Özet

Собственное устройство фотодинамической терапии на основе светодиодов для повышения цитотоксичности вертепорфина в 2D-модели клеточной культуры

Published: January 13, 2023
doi:

Özet

Здесь мы описываем новое, простое и недорогое устройство для успешного выполнения анализов фотодинамической терапии in vitro (PDT) с использованием двумерной культуры клеток HeLa и вертепорфина в качестве фотосенсибилизатора.

Abstract

В этой статье описывается новое, простое и недорогое устройство для выполнения анализов фотодинамической терапии in vitro (PDT), названное PhotoACT. Устройство было построено с использованием набора обычных программируемых светодиодов (LED), модуля жидкокристаллического дисплея (LCD) и датчика освещенности, подключенного к плате коммерческого микроконтроллера. Коробчатая конструкция прототипа была выполнена из древесноволокнистых плит средней плотности (MDF). Внутренний отсек может одновременно выделять четыре многоязычные микропластины клеточной культуры.

В качестве доказательства концепции мы изучили цитотоксический эффект фотосенсибилизатора (PS) вертепорфина против клеточной линии HeLa в двумерной (2D) культуре. Клетки HeLa обрабатывали повышением концентрации вертепорфина в течение 24 ч. Лекарственно-содержащую надпосадочную среду выбрасывали, адгезивные клетки промывали фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS) и добавляли безмедикаментозную среду. В этом исследовании влияние вертепорфина на клетки изучали либо без воздействия света, либо после воздействия света в течение 1 ч с использованием красно-зелено-синих (RGB) значений 255, 255 и 255 (средняя плавность 49,1 ± 0,6 Дж/см2). Через 24 ч жизнеспособность клеток оценивали с помощью анализа 3-(4,5-диметил-2-тиазолил)-2,5-дифенилтетразолия бромида (МТТ).

Экспериментальные результаты показали, что воздействие на клетки, обработанные вертепорфином, на свет от устройства усиливает цитотоксический эффект препарата через механизм, опосредованный активными формами кислорода (АФК). Кроме того, использование прототипа, описанного в этой работе, было подтверждено путем сравнения результатов с коммерческим устройством PDT. Таким образом, этот прототип фотодинамической терапии на основе светодиодов представляет собой хорошую альтернативу для исследований ФДТ in vitro .

Introduction

Среди наиболее смертоносных неинфекционных заболеваний рак представляет собой ведущую глобальную причину преждевременной смерти. На его долю пришлось почти 10 миллионов смертей в 2020 году, что составляет примерно одну из шести смертей во всем мире1. Кроме того, явление множественной лекарственной устойчивости (МЛУ) представляет собой огромную угрозу для общественного здравоохранения, поскольку утвержденные химиотерапевтические протоколы не достигают стадий ремиссии для этого клинического состояния2. Раковые клетки могут развивать устойчивость к химиотерапии через несколько механизмов; однако сверхэкспрессия некоторых АТФ-связывающих кассетных (АВС) транспортеров – АТФ-зависимых эффлюксных насосов – считается основной причиной развития МЛУ в микроокружении опухоли3. В дополнение к MDR, другие осложнения рака, такие как рецидив и метастазирование, усиливают настоятельную потребность в разработке и совершенствовании терапевтических подходов для преодоления этой онкологической проблемы.

Лечебное использование света практикуется на протяжениивеков 4, и фотодинамическая терапия (ФДТ) представляет собой клинически одобренный терапевтический подход для солидных опухолей. ФДТ сочетает в себе введение фотосенсибилизатора (PS) с последующим световым облучением для генерации активных форм кислорода (АФК) для оказания селективной цитотоксичности в опухолевых клетках. Этот терапевтический подход превосходит обычные методы, включая хирургию, облучение и химиотерапию5; это минимально инвазивный метод, показывающий более низкую цитотоксичность в соединительных тканях6. Легкое применение и накопление PS непосредственно в опухоли или ее микросреде обеспечивают точное нацеливание и, следовательно, незначительные, нежелательные системные побочные эффекты7 и возможность повторного лечения на том же участке. Более того, стоимость ниже, чем у других подходов. Благодаря своим многообещающим особенностям ФДТ можно считать подходящим вариантом как для единичных, особенно в случае неоперабельных опухолей, так и для адъювантного лечения рака7, и представляет собой альтернативу МЛУ, связанной с химиотерапией 8,9.

Первый отчет, показывающий высокую объективную частоту ответа с использованием PDT, был описан в 1975 году на мышиной и крысиной модели10. С тех пор исследования проводились с использованием ФДТ с положительными исходами7 как in vivo, так и in vitro с линиями опухолевых клеток человека в 2D клеточной культуре11,12. Учитывая широкую применимость клинически одобренных PS, независимо от их специфических путей накопления и диапазонов длин волн пиков поглощения, общий процесс выглядит следующим образом: (i) поглощение PS, (ii) достижение пика концентрации PS в опухоли или ее микроокружении, (iii) применение света, (iv) взаимодействие PS-света, (v) передача энергии возбужденного состояния PS либо тканевому субстрату, либо окружающим молекулам кислорода, (vi) Производство АФК с участием синглетного кислорода или супероксидного аниона, (vii) гибель опухолевых клеток посредством, по существу, некроза или апоптоза (прямая смерть), аутофагии (цитопротекторный механизм), ишемии тканей (повреждение сосудов), иммунной модуляции или перекрытия этих механизмов7. На этом заключительном этапе активация конкретного пути гибели клеток зависит от многих факторов, таких как характеристики клеток, экспериментальный дизайн и, самое главное, внутриклеточная локализация PS и целенаправленное повреждение, связанное с ФДТ13.

Вертепорфин является PS второго поколения, одобренным регулирующими органами для клинического использования в Норвегии и Китае для лечения возрастной макулярной дегенерации7. Сообщалось, что после доставки дозы этот пролекарство частично накапливается в митохондриях14 и индуцирует фосфорилирование тирозина клеточного белка и фрагментацию ДНК, что приводит к апоптозу опухолевых клеток 15,16. После 24-часовой инкубации для интернализации вертепорфинов рекомендуется протокол PDT с использованием установки длины волны 690 нм для достижения эффективных уровней передачи электромагнитного излучения соседним молекулам 7,17.

Что касается источника света для PDT, классические диодные лазерные системы обычно дорогие, технически сложные, негабаритные и, следовательно, непортируемые18,19. Как следствие его одноволнового профиля, который также можно наблюдать в оборудовании PDT на основе светодиодов, потребность в независимых блоках для каждого применения фотосенсибилизатора делает использование диодных лазерных систем еще более сложным и экономически нецелесообразным20,21. Поэтому использование светодиодной техники считается наиболее перспективной альтернативой для решения не только затрат22 и вопросов технического обслуживания, но и для обеспечения высокой выходной мощности и менее вредной23 и более широкой осветительной способности 24,25,26,27.

Несмотря на потенциальный вклад, который светодиодное оборудование может предложить в эксперименты PDT28, большинство коммерческих вариантов по-прежнему имеют недостатки, такие как отсутствие портативности, высокая стоимость и сложные строительные проекты и эксплуатация29. Основная цель этой работы заключалась в том, чтобы предложить простой и надежный инструмент для анализа PDT in vitro . В этой статье описывается PhotoACT, собственное устройство PDT на основе светодиодов, которое является недорогим, удобным для пользователя и портативным. В качестве доказательства концепции показано, что это устройство усиливает цитотоксичность вертепорфина в модели 2D-культуры клеток и, следовательно, может быть использовано в качестве исследовательского инструмента в экспериментах PDT.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: См. Таблицу материалов для получения подробной информации , относящейся ко всем материалам, реагентам и программному обеспечению, используемым в этом протоколе. 1. Конструкция устройства Пила пилой древесноволокнистых плит средней пл?…

Representative Results

Последнее устройство PDT, названное PhotoACT, включало темную камеру для выделения до четырех многолуночных микропластин, а его верхняя внутренняя поверхность была оснащена набором из 30 рассеянных светодиодов, запрограммированных на испускание различных спектров видимого света (<strong class="xf…

Discussion

Окончательное устройство PhotoACT было удобно строить с коммерчески доступными недорогими компонентами общей стоимостью менее 50 долларов. Дополнительные преимущества включают в себя низкие требования к техническому обслуживанию, способность облучать несколько типов культуральных пла?…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим Артура Энрике Гомеса де Оливейру и Лукаса Джулиана Круза Гомеса за помощь в съемочном процессе. Этот проект был поддержан Бразильским исследовательским советом (CNPq, номера грантов 400953/2016-1-404286/2021-6) и Fundação Araucária-PPSUS 2020/2021 (SUS2020131000003). Это исследование было также частично профинансировано Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES)-Finance Code 001.

Materials

0.5% Trypsin-EDTA (10x) Gibco 15400054 Mammalian cell culture dissociation reagent
3D printer Flashforge Finder model
96-well plates Non-sterile, polystyrene, and high-binding surface plates with flat bottom wells used for 2D cell culture
Arduino
Brightness sensor TSL2561 model with 0.1-40.000+ lux detection levels and I2C interface
Buttons
Buzzer
Cell culture Flasks Sterile, polystyrene, rectangular bottom flask with Tissue Culture (TC)-treated surface, canted neck and vent cap (sizes)
Centrifuge Tubes Sterile, polypropylene tubes with 15/50 mL capacity used for cell culture dilution at seeding step of the assay
CO2 Incubator
Controller board ESP32
Design Software Trimble SketchUp
DMEM High Glucose Gibco 11965092 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) is a widely used basal medium for supporting the growth of many different mammalian cells.
DMSO Sigma-Aldrich D4540-500ML Dimethyl sulfoxide, ≥99.5% (GC), suitable for plant cell culture
Fetal Bovine Serum  Gibco 12657029 FBS provides the best value by delivering consistency of cell growth over time and passages.
Gentamicin (50 mg/mL) Gibco 15750060 Water-soluble antibiotic drug originally purified from the fungus Micromonospora purpurea. Gentamicin acts by preventing cell culture contamination
Hemocytometer Neubauer patterned chamber used for cell counting at seeding step of the assay
Inverted Laboratory Microscope Leica DM IL LED
Laminar Flow Hood Cabin designed to protect the working environment from contaminants by maintaining a constant, unidirectional flow of HEPA-filtered air over the work area. Used at several steps of cell cultivation and treatment procedures
LCD display
LED RGB WS2812 5050 RGB SMD model with a built-in processor. Tape with 30 LEDs, 1 meter length and 9 watts
MDF fiberboards 3mm thickness medium-density fiberboards
Microcentrifuge Tubes Sterile, polypropylene tubes with safety lid and 1.5/2.0 mL capacity. Convenient tools for manipulating small volumes at treatment step of the assay
Microplate reader ThermoFischer Multiskan FC Microplate Photometer designed to detect a broad wavelength range of absorbance (340-850 nm). The equipment was used to evaluate cell viability after MTT incubation.
MTT Reagent Invitrogen M6494 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide. Used for cell viability assays
Operational System Real Time Engineers ltd. FreeRTOS
P10 micripipette Non-electronic, single-channel, 1-10 μL capacity
P1000 micropipette Non-electronic, single-channel, 10-1000 μL capacity
P200 micropipette Non-electronic, single-channel, 20-200 μL capacity
PDT Equipment LumaCare Model LC-122
Phosphate-Buffered Saline pH 7.4 Gibco 10010031 Balanced salt formulation used for washing cells during cultivation and assay procedures
Potentiometers
Tips Non-sterile, universal fit, 10/200/1000 μL maximum volumes
Verteporfin Sigma-Aldrich SML0534-5MG Verteporfin, ≥94% (HPLC)

Referanslar

  1. Ferlay, J., et al. International agency for research on cancer. Global Cancer Observatory: Cancer Today. 23 (7), 323-326 (2018).
  2. Gottesman, M. M., Fojo, T., Bates, S. E. Multidrug resistance in cancer: role of Atp-dependent transporters. Nature Reviews Cancer. 2 (1), 48-58 (2002).
  3. Szakacs, G., Paterson, J. K., Ludwig, J. A., Boothe-Genthe, C., Gottesman, G. A. Targeting multidrug resistance in cancer. Nature Reviews Drug Discovery. 5 (3), 219-234 (2006).
  4. Ackroyd, R., Kelty, C., Brown, N., Reed, M. The history of photodetection and photodynamic therapy. Photochemistry and Photobiology. 74 (5), 656-669 (2001).
  5. Hamblin, M. R. Photodynamic therapy for cancer: what’s past is prologue. Photochemistry and Photobiology. 96 (3), 506-516 (2020).
  6. Barr, H., et al. The contrasting mechanisms of colonic collagen damage between photodynamic therapy and thermal injury. Photochem Photobiol. 46 (5), 795-800 (1987).
  7. Algorri, J. F., Ochoa, M., Roldán-Varona, P., Rodríguez-Cobo, L., López-Higuera, J. M. Photodynamic therapy: A compendium of latest reviews. Cancers. 13 (17), 4447 (2021).
  8. Aniogo, E. C., Plackal, B., George, B. P. A., Abrahamse, H. The role of photodynamic therapy on multidrug resistant breast cancer. Cancer Cell International. 19, 91 (2019).
  9. Spring, B. Q., Rizvi, I., Xu, N., Hasan, T. The role of photodynamic therapy in overcoming cancer drug resistance. Photochemical & Photobiological Sciences. 14 (8), 1476-1491 (2015).
  10. Dougherty, T. J., Grindey, G. B., Fiel, R., Weishaupt, K. R., Boyle, D. G. Photoradiation therapy. II. Cure of animal tumors with hematoporphyrin and light. Journal of the National Cancer Institute. 55 (1), 115-121 (1975).
  11. Etcheverry, M. E., Pasquale, M. A., Garavaglia, M. Photodynamic therapy of HeLa cell cultures by using LED or laser sources. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 160, 271-277 (2016).
  12. Guo, Q., Dong, B., Nan, F., Guan, D., Zhang, Y. 5-Aminolevulinic acid photodynamic therapy in human cervical cancer via the activation of microRNA-143 and suppression of the Bcl-2/Bax signaling pathway. Molecular Medicine Reports. 14 (1), 544-550 (2016).
  13. Mroz, P., Yaroslavsky, A., Kharkwal, G. B., Hamblin, M. R. Cell death pathways in photodynamic therapy of cancer. Cancers. 3 (2), 2516-2539 (2011).
  14. Mahalingam, S. M., Ordaz, J. D., Low, P. S. Targeting of a photosensitizer to the mitochondrion enhances the potency of photodynamic therapy. ACS Omega. 3 (6), 6066-6074 (2018).
  15. Granville, D. J., Levy, J. G., Hunt, D. W. C. Photodynamic treatment with benzoporphyrin derivative monoacid ring A produces protein tyrosine phosphorylation events and DNA fragmentation in murine P815 cells. Photochemistry and Photobiology. 67 (3), 358-362 (1998).
  16. Castano, A. P., Demidova, T. N., Hamblin, M. R. Mechanisms in photodynamic therapy: part two – cellular signaling, cell metabolism and modes of cell death. Photodiagnosis Photodynamic Therapy. 2 (1), 1-23 (2014).
  17. Detty, M. R., Gibson, S. L., Wagner, S. J. Current clinical and preclinical photosensitizers for use in photodynamic therapy. Journal of Medicinal Chemistry. 47 (16), 3897-3915 (2004).
  18. Allison, R. R. Photodynamic therapy: oncologic horizons. Future Oncology. 10 (1), 123-142 (2014).
  19. Chepurna, O., et al. Photodynamic therapy with laser scanning mode of tumor irradiation. Optical Fibers and Their Applications 2015. 9816, 323-326 (2015).
  20. Huang, Z. A review of progress in clinical photodynamic therapy. Technology in Cancer Research and Treatment. 4 (3), 283-293 (2005).
  21. Chepurna, O., et al. LED-based portable light source for photodynamic therapy. Optics in Health Care and Biomedical Optics. 11190, 109-115 (2019).
  22. Hasson, O., Wishkerman, A. CultureLED: A 3D printer-based LED illumination cultivation system for multi-well culture plates. HardwareX. 12, 00323 (2022).
  23. Wu, X., et al. Localised light delivery on melanoma cells using optical microneedles. Biomedical Optics Express. 13 (2), 1045-1060 (2022).
  24. Erkiert-Polguj, A., Halbina, A., Polak-Pacholczyk, I., Rotsztejn, H. Light-emitting diodes in photodynamic therapy in non-melanoma skin cancers-own observations and literature review. Journal of Cosmetic and Laser Therapy. 18 (2), 105-110 (2016).
  25. Neupane, J., Ghimire, S., Shakya, S., Chaudhary, L., Shrivastava, V. P. Effect of light emitting diodes in the photodynamic therapy of rheumatoid arthritis. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 7 (1), 44-49 (2010).
  26. Lins, E. C., et al. A novel 785-nm laser diode-based system for standardization of cell culture irradiation. Photomedicine and Laser Surgery. 31 (10), 466-473 (2013).
  27. Hopkins, S. L., et al. An In vitro cell irradiation protocol for testing photopharmaceuticals and the effect of blue, green, and red light on human cancer cell lines. Photochemical and Photobiological Sciences. 15 (5), 644-653 (2016).
  28. Zhang, K., Waguespack, M., Kercher, E. M., Spring, B. Q. An automated and stable LED array illumination system for multiwell plate cell culture photodynamic therapy experiments. Research Square. , 1-18 (2022).
  29. Gálvez, E. N., et al. Analysis and evaluation of the operational characteristics of a new photodynamic therapy device. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 37, 102719 (2022).
  30. Bretin, L., et al. Photodynamic therapy activity of new human colorectal cancer. Cancers. 11 (10), 1474 (2019).
  31. . T. SketchUp Available from: https://www.sketchup.com/ (2022)
  32. LCDR PhotoDynamic Therapy (PDT) Equipment Repository. GitHub, Inc Available from: https://github.com/PhotoDynamicTherapy (2022)
  33. W3C CSS Color Module Level 3. W3C, Inc Available from: https://www.w3.org/TR/css-color-3/#SRGB (2022)

Play Video

Bu Makaleden Alıntı Yapın
Zanzarini, I. d. S., Barbosa, G., Prado, L. d. O., Zattoni, I. F., Da Paz, G., Prado, A. L. d., Volanski, W., Lavarda, M. D., Rego, F. G. d. M., Picheth, G., Moure, V. R., Valdameri, G. An In-House-Built and Light-Emitting-Diode-Based Photodynamic Therapy Device for Enhancing Verteporfin Cytotoxicity in a 2D Cell Culture Model. J. Vis. Exp. (191), e64391, doi:10.3791/64391 (2023).

View Video