Özet

Un dispositivo di terapia fotodinamica costruito internamente e basato su diodi emettitori di luce per migliorare la citotossicità delle verteporfine in un modello di coltura cellulare 2D

Published: January 13, 2023
doi:

Özet

Qui, descriviamo un dispositivo nuovo, semplice e a basso costo per eseguire con successo saggi di terapia fotodinamica in vitro (PDT) utilizzando colture cellulari HeLa bidimensionali e verteporfina come fotosensibilizzante.

Abstract

Questo documento descrive un dispositivo nuovo, semplice e a basso costo per eseguire saggi di terapia fotodinamica in vitro (PDT), chiamato PhotoACT. Il dispositivo è stato costruito utilizzando una serie di diodi emettitori di luce programmabili convenzionali (LED), un modulo display a cristalli liquidi (LCD) e un sensore di luce collegato a una scheda microcontroller commerciale. La struttura scatolare del prototipo è stata realizzata con pannelli di fibra a media densità (MDF). Il compartimento interno può allocare contemporaneamente quattro micropiastre multipozzetto per colture cellulari.

Come prova di concetto, abbiamo studiato l’effetto citotossico della verteporfina fotosensibilizzatrice (PS) contro la linea cellulare HeLa in coltura bidimensionale (2D). Le cellule HeLa sono state trattate con concentrazioni crescenti di verteporfina per 24 ore. Il mezzo di supernatante contenente farmaco è stato scartato, le cellule aderenti sono state lavate con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) ed è stato aggiunto terreno privo di farmaci. In questo studio, l’effetto della verteporfina sulle cellule è stato esaminato senza esposizione alla luce o dopo l’esposizione per 1 ora alla luce utilizzando valori rosso-verde-blu (RGB) di 255, 255 e 255 (fluenza media di 49,1 ± 0,6 J / cm2). Dopo 24 ore, la vitalità cellulare è stata valutata mediante il test 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difeniltetrazolio bromuro (MTT).

I risultati sperimentali hanno mostrato che l’esposizione delle cellule trattate con verteporfina alla luce del dispositivo aumenta l’effetto citotossico del farmaco attraverso un meccanismo mediato da specie reattive dell’ossigeno (ROS). Inoltre, l’uso del prototipo descritto in questo lavoro è stato convalidato confrontando i risultati con un dispositivo PDT commerciale. Pertanto, questo prototipo di terapia fotodinamica basata su LED rappresenta una buona alternativa per gli studi in vitro di PDT.

Introduction

Tra le malattie non trasmissibili più letali, il cancro rappresenta una delle principali cause globali di morte prematura. Ha rappresentato quasi 10 milioni di morti nel 2020, rappresentando circa un decesso su sei in tutto il mondo1. Inoltre, il fenomeno della resistenza multifarmaco (MDR) rappresenta una tremenda minaccia per la salute pubblica, poiché i protocolli chemioterapici approvati non riescono a raggiungere le fasi di remissione per questa condizione clinica2. Le cellule tumorali possono sviluppare resistenza alla chemioterapia attraverso diversi meccanismi; tuttavia, la sovraespressione di alcuni trasportatori di cassette leganti ATP (ABC) – pompe di efflusso ATP-dipendenti – è considerata la causa principale dello sviluppo di MDR all’interno di un microambiente tumorale3. Oltre all’MDR, altre complicanze del cancro, come la recidiva e le metastasi, rafforzano l’urgente richiesta di sviluppare e migliorare gli approcci terapeutici per superare questa sfida oncologica.

L’utilizzo curativo della luce è stato praticato per secoli4 e la terapia fotodinamica (PDT) rappresenta un approccio terapeutico clinicamente approvato per i tumori solidi. La PDT combina la somministrazione di un fotosensibilizzatore (PS) seguita da irradiazione luminosa per generare specie reattive dell’ossigeno (ROS) per esercitare citotossicità selettiva nelle cellule tumorali. Questo approccio terapeutico è superiore ai metodi convenzionali, tra cui chirurgia, radioterapia e chemioterapia5; È una tecnica minimamente invasiva che mostra una minore citotossicità nei tessuti connettivi6. L’applicazione della luce e l’accumulo di PS direttamente nel tumore o nel suo microambiente assicurano un targeting preciso e, di conseguenza, effetti collaterali sistemici minori e indesiderati7 e la possibilità di ripetere il trattamento nella stessa sede. Inoltre, il costo è inferiore a quello di altri approcci. Per le sue caratteristiche promettenti, la PDT può essere considerata un’opzione appropriata sia per il trattamento del cancro singolo, soprattutto nel caso di tumori inoperabili, sia per il trattamento adiuvante del cancro7, e rappresenta un’alternativa per MDR correlato alla chemioterapia 8,9.

Il primo rapporto che mostrava un alto tasso di risposta obiettiva usando PDT è stato descritto nel 1975 in un modello di topo e ratto10. Da allora, sono stati condotti studi utilizzando PDT con esiti positivi7 sia in vivo che in vitro con linee cellulari tumorali umane in coltura cellulare 2D11,12. Considerando l’ampia applicabilità della PS clinicamente approvata, indipendentemente dalle loro specifiche vie di accumulo e dagli intervalli di lunghezze d’onda dei picchi di assorbimento, il processo generale è il seguente: (i) assorbimento di PS, (ii) picco della concentrazione di PS nel tumore o nel suo microambiente, (iii) applicazione della luce, (iv) interazione PS-luce, (v) trasferimento di energia allo stato eccitato di PS al substrato tissutale o alle molecole di ossigeno circostanti, (vi) produzione di ROS che coinvolge ossigeno singoletto o anione superossido, (vii) morte delle cellule tumorali attraverso, essenzialmente, necrosi o apoptosi (morte diretta), autofagia (meccanismo citoprotettivo), ischemia tissutale (danno vascolare), modulazione immunitaria o una sovrapposizione di questi meccanismi7. In questa fase finale, l’attivazione di una specifica via di morte cellulare dipende da molti fattori, come le caratteristiche cellulari, il disegno sperimentale e, soprattutto, la localizzazione intracellulare della PS e il danno mirato correlato alla PDT13.

La verteporfina è una PS di seconda generazione, approvata dalle agenzie regolatorie per uso clinico in Norvegia e Cina per il trattamento della degenerazione maculare legata all’età7. Dopo la somministrazione della dose, è stato riportato che questo profarmaco si accumula parzialmente nei mitocondri14 e induce la fosforilazione della tirosina proteica cellulare e la frammentazione del DNA, portando all’apoptosi delle cellule tumorali15,16. Dopo 24 ore di incubazione per l’internalizzazione delle verteporfine, si raccomanda un protocollo PDT che utilizza una configurazione di lunghezza d’onda di 690 nm per ottenere livelli efficaci di trasferimento di radiazione elettromagnetica alle molecole adiacenti 7,17.

Per quanto riguarda la sorgente luminosa per PDT, i classici sistemi laser a diodi sono solitamente costosi, tecnicamente complicati, sovradimensionati e quindi non portatili18,19. Come conseguenza del suo profilo a lunghezza d’onda singola, che può essere osservato anche nelle apparecchiature PDT basate su LED, la richiesta di unità indipendenti per ogni applicazione di fotosensibilizzatori rende l’utilizzo di sistemi laser a diodi ancora più complesso ed economicamente impraticabile20,21. Pertanto, l’utilizzo di macchinari a LED è considerato l’alternativa più promettente per risolvere non solo i costi22 e problemi di manutenzione, ma anche per fornire un’elevata potenza e meno dannosa 23 e una più ampia capacità di illuminazione 24,25,26,27.

Nonostante il potenziale contributo che le apparecchiature basate su LED possono offrire agli esperimenti PDT28, la maggior parte delle opzioni commerciali presenta ancora inconvenienti come la mancanza di portabilità, costi elevati e complessi progetti di costruzione e funzionamento29. L’obiettivo principale di questo lavoro era quello di offrire uno strumento semplice e affidabile per i saggi PDT in vitro . Questo documento descrive PhotoACT, un dispositivo PDT basato su LED costruito internamente, che è economico, facile da usare e portatile. Come prova di concetto, questo dispositivo ha dimostrato di migliorare la citotossicità della verteporfina in un modello di coltura cellulare 2D e, pertanto, può essere utilizzato come strumento di ricerca negli esperimenti PDT.

Protocol

NOTA: vedere la tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali, i reagenti e il software utilizzati in questo protocollo. 1. Costruzione del dispositivo Segare pannelli di fibra a media densità (MDF) spessi 3 mm per ottenere pezzi con le dimensioni mostrate in Figura 1A.NOTA: utilizzare il file vettoriale (file supplementare 1) per il taglio a controllo numerico computerizzato (CN…

Representative Results

Il dispositivo PDT finale, chiamato PhotoACT, includeva una camera oscura per allocare fino a quattro micropiastre multipozzetto, con la sua superficie interna superiore dotata di un set di 30 LED diffusi programmati per emettere spettri distinti di luce visibile (Figura 3 e File supplementare 6). Il dispositivo è stato costruito utilizzando due scatole associate: una scatola interna progettata come camera oscura per i saggi PDT e una scatola esterna per coprire la camera i…

Discussion

Il dispositivo PhotoACT finale era comodo da costruire con componenti disponibili in commercio e a basso costo ad un costo totale inferiore a $ 50. Ulteriori vantaggi includono basse esigenze di manutenzione, la capacità di irradiare più tipi di piastre di coltura, l’uso simultaneo di un massimo di quattro unità per test, peso ridotto (2 kg)/dimensioni (44 cm3) che consente portabilità, irradiazione accurata e riproducibile (dati non mostrati) e un’interfaccia di configurazione semplice e intuitiva che non…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo Arthur Henrique Gomes de Oliveira e Lucas Julian Cruz Gomes per l’aiuto nel processo di ripresa. Questo progetto è stato sostenuto dal Consiglio brasiliano delle ricerche (CNPq, numero di sovvenzione 400953/2016-1-404286/2021-6) e dalla Fundação Araucária-PPSUS 2020/2021 (SUS2020131000003). Questo studio è stato anche finanziato in parte dal Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES)-Finance Code 001.

Materials

0.5% Trypsin-EDTA (10x) Gibco 15400054 Mammalian cell culture dissociation reagent
3D printer Flashforge Finder model
96-well plates Non-sterile, polystyrene, and high-binding surface plates with flat bottom wells used for 2D cell culture
Arduino
Brightness sensor TSL2561 model with 0.1-40.000+ lux detection levels and I2C interface
Buttons
Buzzer
Cell culture Flasks Sterile, polystyrene, rectangular bottom flask with Tissue Culture (TC)-treated surface, canted neck and vent cap (sizes)
Centrifuge Tubes Sterile, polypropylene tubes with 15/50 mL capacity used for cell culture dilution at seeding step of the assay
CO2 Incubator
Controller board ESP32
Design Software Trimble SketchUp
DMEM High Glucose Gibco 11965092 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) is a widely used basal medium for supporting the growth of many different mammalian cells.
DMSO Sigma-Aldrich D4540-500ML Dimethyl sulfoxide, ≥99.5% (GC), suitable for plant cell culture
Fetal Bovine Serum  Gibco 12657029 FBS provides the best value by delivering consistency of cell growth over time and passages.
Gentamicin (50 mg/mL) Gibco 15750060 Water-soluble antibiotic drug originally purified from the fungus Micromonospora purpurea. Gentamicin acts by preventing cell culture contamination
Hemocytometer Neubauer patterned chamber used for cell counting at seeding step of the assay
Inverted Laboratory Microscope Leica DM IL LED
Laminar Flow Hood Cabin designed to protect the working environment from contaminants by maintaining a constant, unidirectional flow of HEPA-filtered air over the work area. Used at several steps of cell cultivation and treatment procedures
LCD display
LED RGB WS2812 5050 RGB SMD model with a built-in processor. Tape with 30 LEDs, 1 meter length and 9 watts
MDF fiberboards 3mm thickness medium-density fiberboards
Microcentrifuge Tubes Sterile, polypropylene tubes with safety lid and 1.5/2.0 mL capacity. Convenient tools for manipulating small volumes at treatment step of the assay
Microplate reader ThermoFischer Multiskan FC Microplate Photometer designed to detect a broad wavelength range of absorbance (340-850 nm). The equipment was used to evaluate cell viability after MTT incubation.
MTT Reagent Invitrogen M6494 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide. Used for cell viability assays
Operational System Real Time Engineers ltd. FreeRTOS
P10 micripipette Non-electronic, single-channel, 1-10 μL capacity
P1000 micropipette Non-electronic, single-channel, 10-1000 μL capacity
P200 micropipette Non-electronic, single-channel, 20-200 μL capacity
PDT Equipment LumaCare Model LC-122
Phosphate-Buffered Saline pH 7.4 Gibco 10010031 Balanced salt formulation used for washing cells during cultivation and assay procedures
Potentiometers
Tips Non-sterile, universal fit, 10/200/1000 μL maximum volumes
Verteporfin Sigma-Aldrich SML0534-5MG Verteporfin, ≥94% (HPLC)

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Bu Makaleden Alıntı Yapın
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