Qui presentiamo un protocollo per isolare i nuclei dal cervello del modello di vertebrati di breve durata Nothobranchius furzeri per applicazioni a valle come il sequenziamento dell’RNA a singolo nucleo o il saggio a nucleo singolo per la cromatina accessibile alla trasposasi con sequenziamento (ATAC-seq).
Studiare l’invecchiamento cerebrale alla risoluzione di singole cellule nei sistemi di vertebrati rimane impegnativo a causa di costi, tempi e vincoli tecnici. Qui, dimostriamo un protocollo per generare librerie di sequenziamento dell’RNA a singolo nucleo (snRNA-seq) dal cervello del killifish turchese africano vertebrato naturalmente di breve durata Nothobranchius furzeri. Il killifish turchese africano ha una durata di vita di 4-6 mesi e può essere ospitato in modo economico, riducendo così i costi e i tempi per studiare l’invecchiamento cerebrale dei vertebrati. Tuttavia, sono necessari protocolli su misura per isolare nuclei di qualità sufficiente per esperimenti a valle a singola cellula dal cervello di pesci giovani e anziani. Qui, dimostriamo un protocollo empiricamente ottimizzato per l’isolamento di nuclei di alta qualità dal cervello di killifish turchesi africani adulti, un passo fondamentale nella generazione di librerie omiche a singoli nuclei di alta qualità. Inoltre, dimostriamo che i passaggi per ridurre l’RNA di fondo contaminante sono importanti per distinguere chiaramente i tipi di cellule. In sintesi, questo protocollo dimostra la fattibilità dello studio dell’invecchiamento cerebrale in organismi modello di vertebrati non tradizionali.
Comprendere i meccanismi dell’invecchiamento cerebrale dei vertebrati è fondamentale per affrontare le malattie neurodegenerative legate all’età come l’Alzheimer e la demenza1. Il killifish turchese africano (Nothobranchus furzeri) è il vertebrato più breve che può essere allevato in cattività e, grazie alla sua breve durata di vita e al deterioramento cognitivo associato all’età, è un eccellente modello di invecchiamento cerebrale 2,3,4,5. Recentemente, l’avvento di tecnologie “omiche” a singola cellula, come l’RNA-seq a nucleo singolo (snRNA-seq) e il saggio a nucleo singolo per la cromatina accessibile alla trasposasi con sequenziamento (snATAC-seq), hanno permesso ai ricercatori di interrogare il cervello che invecchia a una risoluzione senza precedenti 6,7,8. Questi metodi si basano sull’isolamento dei nuclei, poiché il recupero delle cellule cerebrali come i neuroni è spesso troppo difficile da isolare 6,7,8,9,10. Tuttavia, la maggior parte dei protocolli di isolamento dei nuclei pubblicati sono ottimizzati per organismi modello di mammiferi 11,12,13,14,15. Pertanto, poiché attualmente esiste un bisogno insoddisfatto di isolare i nuclei cerebrali nel killifish come nuovo organismo modello emergente nel campo della ricerca sull’invecchiamento2, l’obiettivo di questo protocollo è stabilire un metodo per isolare nuclei di alta qualità dal tessuto killifish cerebrale congelato.
Qui, viene stabilito un flusso di lavoro semplificato e robusto che utilizza materiali comunemente disponibili per isolare nuclei di alta qualità dai cervelli killifish. Questo protocollo è stato modificato da un protocollo di genomica 10x per cervelli di topo per accogliere i cervelli a basso contenuto di mielina del killifish turchese africano, la fragilità del tessuto congelato e la necessità di ridurre il contenuto di detriti ambientali per applicazioni correlate al sequenziamento16. Infatti, protocolli precedentemente ottimizzati per il tessuto cerebrale dei mammiferi17,18 portano a una scarsa qualità dei nuclei (cioè overlysis) e / o ad un alto contenuto di detriti quando utilizzati su cervelli di killifish congelati, rendendoli inadatti per l’uso con snRNA-seq secondo le raccomandazioni per i singoli nuclei RNA-seq usando la microfluidica (Figura supplementare 1).
Oltre all’isolamento dei nuclei, dimostriamo come valutare la qualità e la resa dei nuclei mediante microscopia e citometria a flusso. In questo articolo vengono forniti esempi di risultati ottimali e non ottimali e viene illustrata la risoluzione dei problemi. Questo protocollo è stato progettato e ottimizzato per i cervelli di killifish congelati, ma può anche essere utilizzato senza grandi modifiche su campioni di killifish appena sezionati. I nuclei cerebrali di Killifish isolati usando questo metodo sono stati ottimizzati per l’uso in RNA-seq a singolo nucleo (snRNA-seq) come applicazione a valle, ma dovrebbero anche essere suscettibili di uso in snATAC-seq e bulk ATAC-seq.
Il protocollo qui presentato può essere utilizzato per generare in modo riproducibile nuclei di alta qualità da cervelli killifish. Questo protocollo doveva essere specificamente progettato per il cervello killifish poiché i tipici protocolli di isolamento dei nuclei cerebrali basati sui mammiferi applicati ai cervelli killifish hanno costantemente portato a una scarsa qualità dei nuclei nelle nostre mani. Sospettiamo che ciò sia dovuto al più basso contenuto di mielina relativa del cervello killifish rispetto alle loro controparti dei mammiferi, che si liserebbero e si aggregherebbero in risposta alle dure condizioni richieste per la lisi delle cellule cerebrali dei mammiferi. Questo protocollo è un progresso nei campi dell’invecchiamento e dei killifish in quanto facilita l’esplorazione dell’invecchiamento cerebrale a livello di singola cellula in un modello economico e tempestivo di invecchiamento cerebrale dei vertebrati.
Questo protocollo è robusto per campioni freschi o congelati, anche se è necessario considerare le applicazioni a valle quando si utilizza tessuto fresco o congelato. Il tessuto congelato è spesso conveniente in quanto può essere raccolto e conservato per mesi mentre vengono raccolti i campioni. Tali campioni possono essere tranquillamente utilizzati per applicazioni come snRNA-seq. Tuttavia, il congelamento dei campioni può interrompere la struttura nucleare e quindi la capacità di misurare con precisione il paesaggio cromatinico da ATAC-seq21. Pertanto, per applicazioni a valle come ATAC-seq o snATAC-seq, si raccomanda di utilizzare cervelli appena sezionati invece di cervelli congelati. Inoltre, poiché tutti i passaggi dopo l’omogeneizzazione cerebrale possono essere eseguiti in parallelo, questo protocollo è suscettibile di eseguire più campioni in un lasso di tempo ragionevole, limitando così la degradazione dell’RNA causata da un’incubazione prolungata sul ghiaccio.
Inoltre, è imperativo preparare i tamponi freschi (entro poche ore) dall’esecuzione dell’estrazione dei nuclei. Abbiamo scoperto che i detergenti e BSA devono essere aggiunti ai tamponi immediatamente prima di iniziare il protocollo. I tamponi contenenti solo sali (PBS, NaCl, ecc.) possono essere prodotti come concentrati, sterilizzati con filtro (0,22 μm) e conservati a tempo indeterminato a temperatura ambiente. Le soluzioni madre BSA possono essere preparate, sterilizzate e conservate a 4 °C entro pochi giorni dall’estrazione dei nuclei (se preparate da polvere), ma devono sempre essere aggiunte ai tamponi utilizzati in questo protocollo immediatamente prima di intraprendere il protocollo. Tuttavia, si consiglia di preparare le soluzioni BSA il giorno del protocollo. Se si utilizzano soluzioni BSA prefabbricate da terzi, si consiglia di utilizzare bottiglie fresche e non aperte. L’uso di BSA fresco porta generalmente a un contenuto inferiore di detriti nella preparazione dei nuclei.
Sia che vengano utilizzati campioni freschi o congelati come input, è importante valutare la qualità dei nuclei dopo l’isolamento dei nuclei. Sebbene questo protocollo sia specificamente progettato per evitare l’eccessiva, questa è la causa più comune di perdita di qualità dei nuclei. L’eccessiva lisi può derivare da un tempo eccessivo trascorso nel tampone di lisi, da una manipolazione eccessivamente approssimativa dei nuclei come un pipettaggio eccessivo con una punta di pipetta standard o da una quantità eccessiva di tempo trascorso tra l’isolamento dei nuclei e le applicazioni a valle (>1 ora). I nuclei sovralisati hanno spesso periferie nucleari danneggiate, che perdono DNA e causano aggregazione (Figura 2B). Ciò porterà ad un aumento del numero di multipletti e contribuirà agli acidi nucleici di fondo che interferiranno con le applicazioni a valle, in particolare snRNA-seq. Entrambe le qualità possono essere valutate al microscopio dopo l’isolamento dei nuclei. Se si osserva un eccessivo aggregazione nucleare, si consiglia di provare ad abbreviare l’incubazione della fase di lisi per ridurre la possibilità di iperlisi. Come metodo alternativo per aumentare i singoletti dei nuclei, la selezione cellulare assistita da fluorescenza (FACS) può essere utilizzata per arricchire i singoletti a valle di questo protocollo. Tuttavia, notiamo che, quando si lavora con nuclei già fragili da tessuto congelato, lo stress di taglio che si verifica durante la selezione può portare ad un aumento della rottura nucleare e quindi ad un aumento dell’RNA / DNA ambientale. Inoltre, notiamo che il tempo necessario per eseguire un FACS yield sort per i nuclei durante l’elaborazione di più campioni richiederebbe che tutti i campioni di nuclei rimangano sul ghiaccio per ore, mentre altri campioni vengono ordinati. Pertanto, l’aumento dei tempi di attesa durante l’elaborazione di più campioni in parallelo con l’approccio FACS potrebbe anche portare a una qualità complessiva ridotta dei nuclei e aumentare il rischio di degradazione dell’RNA. Pertanto, se FACS è desiderato per una velocità di doppietto ridotta, raccomandiamo che il contenuto di detriti venga controllato nuovamente dopo il tipo di resa e che la possibile qualità ridotta dell’RNA sia presa in considerazione per le applicazioni di RNA-seq a singola cellula come potenziale avvertimento.
Una stima accurata della conta dei nuclei e della proporzione di singoletto è essenziale per quasi tutte le applicazioni “omiche” a valle ed è della massima importanza. Grazie alla capacità di controllare e contare facilmente i nuclei per dimensione, la citometria a flusso è il metodo più accurato di conteggio dei nuclei che abbiamo valutato. In alternativa, è possibile quantificare i nuclei utilizzando contatori di cellule come il contatore automatico di cellule Countess 2 FL di Invitrogen o il contatore automatico di celle DeNovix CellDrop. Da notare, il contatore automatico di celle Countess 2 FL di Invitrogen e, in misura molto minore, il DeNovix, tendono a sovrastimare i conteggi dei nuclei contando i detriti come nuclei, il che significa che potrebbe essere necessario il gating manuale delle dimensioni. Inoltre, il citometro a flusso consente di valutare facilmente la purezza dei nuclei. Si può discernere la proporzione relativa dei nuclei di singoletto rispetto ai nuclei di multipletti in un modo quantitativo che è difficile al microscopio. Ciò è vitale per snRNA-seq e snATAC-seq, poiché tali protocolli soffriranno di un surplus di campioni multipli, che devono essere esclusi dalle analisi a valle. Oltre ai multipletti, la proporzione relativa di “detriti” (nuclei frammentati, detriti cellulari) può essere quantificata mediante citometria a flusso e deve essere relativamente bassa, poiché questo materiale contiene spesso acidi nucleici contaminanti che possono contribuire a un segnale di fondo e corrompere i dati “omici” del singolo nucleo.
Come per i protocolli di isolamento dei nuclei precedentemente descritti, le proporzioni dei tipi cellulari nel tessuto originale potrebbero non essere ricapitolate fedelmente nella preparazione dei nuclei19, e quindi dovrebbero essere interpretate con cautela. Da notare, come tutti i teleostei, i killifish turchesi africani hanno eritrociti nucleati, che dovrebbero anche essere rappresentati nella preparazione dei nuclei. Questi nuclei possono essere identificati nei set di dati snRNA-seq e snATAC-seq dalla maggiore espressione/accessibilità dei geni dell’emoglobina e possono essere esclusi computazionalmente se lo si desidera.
The authors have nothing to disclose.
Alcuni pannelli sono stati generati con BioRender.com. Questo lavoro nel nostro laboratorio è stato supportato dal NIA T32 AG052374 Postdoctoral Training Grant a B.T., una sovvenzione della Simons Foundation come parte della Simons Collaboration for Plasticity in the Aging Brain, una sovvenzione pilota della Navigage Foundation e un premio Hanson-Thorell Family a B.A.B.
0.4% Trypan Blue solution | Gibco | 15250061 | |
10x PBS | Bioland | PBS01-03 | |
15 mL Conicle Centrifuge Tube | VWR | 89039-664 | |
2 mL Tissue Grinder | Kimble | 885300-0002 | Dounce Homogenizer |
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube | Falcon | 352054 | |
5M Sodium Chloride, Molecular Biology Grade | Promega | V4221 | |
autoMACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | This corresponds to 1x PBS pH 7.2, 2 mM EDTA (used for flow cytometry) |
Debris Removal Solution | Miltenyi Biotec | 130-109-398 | |
DNA LoBInd Tube | Eppendorf | 22431021 | |
Echo Revolve microscope (fitted with 60x objective) | Echo | NA | No catalog number; Used to visually inspect nuclei. |
Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes, 5 mL | Falcon | 352052 | FACS tube |
FLOWMI Cell Strainers, 40 μM | SP Bel-Art | 136800040 | Referred to as on-tip filters in Protocol |
Hydrochloric Acid | Sigma-Alrdich | 258146-500 mL | Used to lower TRIS pH from 8.0 to 7.4 |
Leica EZ4 dissecting scope | Leica | NA | No catalog number |
MACS BSA stock solution | Miltenyi Biotec | 130091376 | |
MACS SmartStrainers (70 μM) | Miltenyi Biotec | 130-110-916 | |
MACSQuant Analyzer 10 Flow Cytometer | Miltenyi Biotec | NA | No catalog number |
Magnesium Chloride, Hexahydrate, Molecular Biology Grade (Powder) | Millipore | 442611 | |
Megafuge 16R Centrifuge | ThermoScientific | 75003629 | |
Micro Cover Glass | VWR | 48393081 | |
Micro Slides Superfrost Plus | VWR | 48311-703 | |
Nonidet P-40 Substitute | Roche | (Roche) 11332473001/ Catalog: 983739 P Code: -102368106 (Sigma Aldrich) | |
NP-40 Surfact-Amps Detergent Solution | ThermoFisher | 85124 | |
Nuclease-Free HyPure Molecular Biology Grade Water | HyClone | SH30538.02 | |
NxGen RNase Inhibitor (50,000 U) | Lucigen | 30281-2 | |
Propidium Iodide solution | MBL | FP00010020 | |
PureBlu DAPI Nuclear Staining Dye | Biorad | 1351303 | |
TipOne RPT Pipette Tips (Ultra low retention, filtered) in 10 µL, 20 µL, 200 µL, and 1000 µL sizes | USA Scientific | #1181-3810; #1180-1810; #1180-8810; #1182-1830 | |
Tricaine-S (MS 222) | Syndel | Tricaine10G | Syndel is an FDA-approved provider for pharmaceutical grade Tricaine |
TRIS, 1 M, pH 8.0 | VWR | E199-500 mL | |
Wide Bore Pipet Tips | Axygen | T-1005-WB-C |