여기에서 우리는 단일 핵 RNA 시퀀싱 또는 시퀀싱을 사용한 트랜스포자제 접근 염색질에 대한 단일 핵 분석(ATAC-seq)과 같은 다운스트림 애플리케이션을 위해 수명이 짧은 척추동물 모델 Nothobranchius furzeri의 뇌에서 핵을 분리하는 프로토콜을 제시합니다.
척추 동물 시스템에서 단일 세포 분해능으로 뇌 노화를 연구하는 것은 비용, 시간 및 기술적 제약으로 인해 여전히 어렵습니다. 여기에서는 자연적으로 수명이 짧은 척추동물 아프리카 청록색 킬리피시 Nothobranchius furzeri의 뇌에서 단일 핵 RNA 시퀀싱(snRNA-seq) 라이브러리를 생성하는 프로토콜을 시연합니다. 아프리카 청록색 킬리 피쉬는 4-6 개월의 수명을 가지고 있으며 비용 효율적인 방식으로 수용 할 수 있으므로 척추 동물의 뇌 노화를 연구하는 데 드는 비용과 시간 장벽을 줄일 수 있습니다. 그러나 젊은 물고기와 노인 물고기의 뇌에서 다운 스트림 단일 세포 실험에 충분한 품질의 핵을 분리하기 위해서는 맞춤형 프로토콜이 필요합니다. 여기에서는 고품질 단일 핵 오믹 라이브러리 생성의 중요한 단계인 성인 아프리카 청록색 킬리피쉬의 뇌에서 고품질 핵을 분리하기 위한 경험적으로 최적화된 프로토콜을 시연합니다. 또한, 우리는 오염 배경 RNA를 줄이는 단계가 세포 유형을 명확하게 구별하는 데 중요하다는 것을 보여줍니다. 요약하면,이 프로토콜은 비 전통적인 척추 동물 모델 유기체에서 뇌 노화를 연구 할 가능성을 보여줍니다.
척추동물의 뇌 노화 메커니즘을 이해하는 것은 알츠하이머 및 치매와 같은 노화 관련 신경퇴행성 질환을 해결하는 데중요합니다1. 아프리카 청록색 킬리 피쉬 (Nothobranchus furzeri)는 포로 상태에서 사육 할 수있는 가장 수명이 짧은 척추 동물이며 짧은 수명과 연령 관련인지 장애로 인해 우수한 뇌 노화 모델 2,3,4,5입니다. 최근 단일 핵 RNA-seq (snRNA-seq) 및 시퀀싱을 통한 트랜스포자제 접근 가능 염색질에 대한 단일 핵 분석 (snATAC-seq)과 같은 단일 세포 “오믹스”기술의 출현으로 연구자들은 전례없는 해상도 6,7,8로 노화 된 뇌를 조사 할 수있었습니다. 이러한 방법은 뉴런과 같은 뇌 세포의 회복이 종종 6,7,8,9,10을 분리하기에는 너무 어렵 기 때문에 핵 분리에 의존합니다. 그러나, 대부분의 공개된 핵 분리 프로토콜은 포유동물 모델 유기체 11,12,13,14,15에 대해 최적화된다. 따라서, 현재 노화 연구2 분야에서 떠오르는 새로운 모델 유기체로서 킬리피쉬의 뇌핵을 분리하는 데 대한 충족되지 않은 요구가 있기 때문에, 이 프로토콜의 목표는 동결된 뇌 킬리피쉬 조직으로부터 고품질 핵을 분리하는 방법을 확립하는 것이다.
여기에서는 일반적으로 사용 가능한 재료를 사용하여 킬리피쉬 뇌에서 고품질 핵을 분리하는 능률적이고 강력한 워크플로가 설정됩니다. 이 프로토콜은 아프리카 청록색 킬리 피쉬의 낮은 미엘린 함량 뇌, 냉동 조직의 취약성 및 시퀀싱 관련 응용 분야의 주변 파편 함량을 줄여야 할 필요성을 수용하기 위해 마우스 뇌에 대한 10x Genomics 프로토콜에서 수정되었습니다16. 실제로, 포유류의 뇌 조직17,18에 대해 이전에 최적화 된 프로토콜은 냉동 킬리 피쉬 뇌에 사용될 때 핵 품질 저하 (즉, 과잉 용해) 및 / 또는 높은 파편 함량을 초래하여 미세 유체 공학을 사용하는 단일 핵 RNA-seq에 대한 권장 사항에 따라 snRNA-seq와 함께 사용하기에 적합하지 않습니다 (보충 그림 1).
핵 분리 외에도 현미경 및 유세포 분석을 통해 핵 품질과 수율을 평가하는 방법을 보여줍니다. 이 문서에서는 최적 결과와 최적이 아닌 결과의 예를 제공하고 문제 해결에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 냉동 킬리피쉬 뇌를 위해 설계 및 최적화되었지만 갓 해부된 킬리피쉬 샘플에 대한 주요 수정 없이 사용할 수도 있습니다. 이 방법을 사용하여 분리된 킬리피쉬 뇌핵은 다운스트림 애플리케이션으로 단일 핵 RNA-seq(snRNA-seq)에 사용하도록 최적화되었지만 snATAC-seq 및 벌크 ATAC-seq에도 사용할 수 있어야 합니다.
여기에 제시된 프로토콜은 킬리피쉬 뇌에서 고품질 핵을 재현 가능하게 생성하는 데 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 킬리피쉬 뇌에 적용된 전형적인 포유류 기반 뇌핵 분리 프로토콜이 지속적으로 우리 손의 핵 품질을 저하시켰기 때문에 킬리피쉬 뇌를 위해 특별히 설계되어야 했습니다. 우리는 이것이 포유류의 뇌 세포 용해에 필요한 가혹한 조건에 반응하여 용해되고 응집되는 포유류에 비해 킬리 피쉬 뇌의 상대적 미엘린 함량이 낮기 때문이라고 생각합니다. 이 프로토콜은 척추 동물의 뇌 노화의 비용 및 시간 효율적인 모델에서 단일 세포 수준에서 뇌 노화의 탐구를 용이하게하기 때문에 노화 및 킬리 피쉬 분야의 발전입니다.
이 프로토콜은 신선 또는 냉동 샘플에 강력하지만 신선 또는 냉동 조직을 사용할 때 다운스트림 응용 분야를 고려해야 합니다. 냉동 조직은 샘플을 수집하는 동안 몇 달 동안 수집하고 보관할 수 있기 때문에 종종 편리합니다. 이러한 샘플은 snRNA-seq와 같은 애플리케이션에 안전하게 사용될 수 있습니다. 그러나 샘플을 동결하면 핵 구조가 파괴되어 ATAC-seq21로 염색질 풍경을 정확하게 측정 할 수 있습니다. 따라서 벌크 ATAC-seq 또는 snATAC-seq와 같은 다운스트림 애플리케이션의 경우 냉동 뇌 대신 새로 해부된 뇌를 사용하는 것이 좋습니다. 또한 뇌 균질화 이후의 모든 단계를 병렬로 수행 할 수 있기 때문에이 프로토콜은 합리적인 시간 내에 여러 샘플을 실행할 수 있으므로 얼음에서의 장기간 배양으로 인한 RNA 분해를 제한합니다.
또한, 핵 추출을 수행하는 후 신선한 (몇 시간 이내에) 완충액을 준비하는 것이 필수적입니다. 우리는 BSA뿐만 아니라 세제도 프로토콜을 시작하기 직 전에 버퍼에 추가되어야 한다는 것을 발견했습니다. 염(PBS, NaCl 등)만을 포함하는 완충액은 농축액으로 만들어 필터 멸균(0.22μm)하여 실온에서 무기한 보관할 수 있다. BSA 스톡 용액은 핵 추출 후 며칠 이내에 4°C에서 제조, 멸균 및 저장될 수 있지만(분말로 제조된 경우) 프로토콜을 수행하기 직전에 항상 이 프로토콜에 사용되는 완충액에 첨가해야 합니다. 그러나 프로토콜 당일에 BSA 솔루션을 준비하는 것이 좋습니다. 타사의 미리 만들어진 BSA 용액을 사용하는 경우, 개봉하지 않은 새 병을 사용하는 것이 좋습니다. 새로운 BSA를 사용하면 일반적으로 핵 준비에서 파편 함량이 낮아집니다.
신선 또는 냉동 샘플을 입력으로 사용하든 핵 분리 후 핵 품질을 평가하는 것이 중요합니다. 이 프로토콜은 과용해를 방지하기 위해 특별히 설계되었지만 이것이 핵 품질 손실의 가장 일반적인 원인입니다. 과잉 용해는 용해 완충액에서 너무 많은 시간을 소비하거나, 표준 보어 피펫 팁을 사용한 과도한 피펫팅과 같은 핵의 지나치게 거친 취급 또는 핵 분리와 다운스트림 적용 사이에 소요되는 과도한 시간(>1시간)으로 인해 발생할 수 있습니다. 과도하게 용해된 핵은 종종 핵 주변부를 손상시켜 DNA를 누출시키고 응집을 유발합니다(그림 2B). 이것은 증가된 다수의 멀티플릿으로 이어질 것이고 다운스트림 응용, 특히 snRNA-seq를 방해할 배경 핵산에 기여할 것이다. 두 특성 모두 핵 분리 후 현미경으로 평가할 수 있습니다. 과도한 핵 응집이 관찰되면 과다 용해 가능성을 줄이기 위해 용해 단계 배양을 단축하는 것이 좋습니다. 핵 싱글릿을 증가시키기 위한 대안적인 방법으로서, 형광-보조 세포 분류 (FACS)가 이 프로토콜의 다운스트림 싱글렛에 대해 농축하기 위해 사용될 수 있다. 그러나 동결된 조직에서 이미 깨지기 쉬운 핵으로 작업할 때 분류 중에 발생하는 전단 응력으로 인해 핵 파열이 증가하여 주변 RNA/DNA가 증가할 수 있습니다. 또한 여러 샘플을 처리할 때 핵에 대한 FACS 수율 정렬을 실행하는 데 필요한 시간은 다른 샘플이 분류되는 동안 모든 핵 샘플이 몇 시간 동안 얼음 위에 남아 있어야 한다는 점에 주목합니다. 따라서 FACS 접근법과 병행하여 여러 샘플을 처리 할 때 대기 시간이 증가하면 전반적인 핵 품질이 저하되고 RNA 분해 위험이 증가 할 수 있습니다. 따라서 FACS가 이중 속도 감소를 원하는 경우 수율 분류 후 파편 함량을 다시 확인하고 잠재적 인 경고로 단일 세포 RNA-seq 응용 프로그램에 대해 RNA 품질 저하 가능성을 고려하는 것이 좋습니다.
핵 수와 일중항 비율의 정확한 추정치는 거의 모든 다운스트림 “omics” 응용 분야에 필수적이며 가장 중요합니다. 크기별로 핵을 쉽게 게이트하고 계수할 수 있는 능력으로 인해 유세포분석은 우리가 평가한 가장 정확한 핵 계수 방법입니다. 또는 Invitrogen의 Countess 2 FL 자동 세포 카운터 또는 DeNovix CellDrop 자동 세포 카운터와 같은 세포 카운터를 사용하여 핵을 정량화할 수 있습니다. 참고로, Invitrogen의 Countess 2 FL 자동 세포 카운터와 DeNovix는 파편을 핵으로 계산하여 핵 수를 과대평가하는 경향이 있으며, 이는 수동 크기 게이팅이 필요할 수 있음을 의미합니다. 또한 유세포 분석기를 사용하면 핵의 순도를 쉽게 평가할 수 있습니다. 단중항 대 다중 핵의 상대적 비율을 현미경으로는 어려운 정량적 방식으로 식별할 수 있습니다. 이는 snRNA-seq 및 snATAC-seq에 매우 중요한데, 이는 이러한 프로토콜이 다운스트림 분석에서 제외되어야 하는 다중 샘플의 잉여로 어려움을 겪을 것이기 때문입니다. 다중 항목 외에도 “파편”(단편화 된 핵, 세포 파편)의 상대적 비율은 유세포 분석으로 정량화 할 수 있으며,이 물질은 종종 배경 신호 및 손상된 단일 핵 “omics”데이터에 기여할 수있는 오염 핵산을 포함하기 때문에 상대적으로 낮아야합니다.
이전에 기술된 핵 분리 프로토콜과 마찬가지로, 원래 조직에서 세포 유형의 비율은 핵 준비19에서 충실하게 요약되지 않을 수 있으므로 주의해서 해석해야 합니다. 참고로, 모든 teleosts와 마찬가지로, 아프리카 청록색 킬리 피쉬는 핵 적혈구를 가지고 있으며, 이는 또한 핵 준비에서 나타날 것으로 예상됩니다. 이러한 핵은 헤모글로빈 유전자의 더 높은 발현/접근성에 의해 snRNA-seq 및 snATAC-seq 데이터 세트에서 식별될 수 있으며 원하는 경우 계산적으로 제외될 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
일부 패널은 BioRender.com 로 생성되었습니다. 우리 실험실에서의 이 연구는 NIA T32 AG052374 BT에 대한 박사후 교육 보조금, 노화 뇌의 가소성을 위한 Simons Collaboration의 일환으로 Simons Foundation의 보조금, Navigage Foundation의 파일럿 보조금 및 BAB에 대한 Hanson-Thorell Family 상의 지원을 받았습니다.
0.4% Trypan Blue solution | Gibco | 15250061 | |
10x PBS | Bioland | PBS01-03 | |
15 mL Conicle Centrifuge Tube | VWR | 89039-664 | |
2 mL Tissue Grinder | Kimble | 885300-0002 | Dounce Homogenizer |
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube | Falcon | 352054 | |
5M Sodium Chloride, Molecular Biology Grade | Promega | V4221 | |
autoMACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | This corresponds to 1x PBS pH 7.2, 2 mM EDTA (used for flow cytometry) |
Debris Removal Solution | Miltenyi Biotec | 130-109-398 | |
DNA LoBInd Tube | Eppendorf | 22431021 | |
Echo Revolve microscope (fitted with 60x objective) | Echo | NA | No catalog number; Used to visually inspect nuclei. |
Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes, 5 mL | Falcon | 352052 | FACS tube |
FLOWMI Cell Strainers, 40 μM | SP Bel-Art | 136800040 | Referred to as on-tip filters in Protocol |
Hydrochloric Acid | Sigma-Alrdich | 258146-500 mL | Used to lower TRIS pH from 8.0 to 7.4 |
Leica EZ4 dissecting scope | Leica | NA | No catalog number |
MACS BSA stock solution | Miltenyi Biotec | 130091376 | |
MACS SmartStrainers (70 μM) | Miltenyi Biotec | 130-110-916 | |
MACSQuant Analyzer 10 Flow Cytometer | Miltenyi Biotec | NA | No catalog number |
Magnesium Chloride, Hexahydrate, Molecular Biology Grade (Powder) | Millipore | 442611 | |
Megafuge 16R Centrifuge | ThermoScientific | 75003629 | |
Micro Cover Glass | VWR | 48393081 | |
Micro Slides Superfrost Plus | VWR | 48311-703 | |
Nonidet P-40 Substitute | Roche | (Roche) 11332473001/ Catalog: 983739 P Code: -102368106 (Sigma Aldrich) | |
NP-40 Surfact-Amps Detergent Solution | ThermoFisher | 85124 | |
Nuclease-Free HyPure Molecular Biology Grade Water | HyClone | SH30538.02 | |
NxGen RNase Inhibitor (50,000 U) | Lucigen | 30281-2 | |
Propidium Iodide solution | MBL | FP00010020 | |
PureBlu DAPI Nuclear Staining Dye | Biorad | 1351303 | |
TipOne RPT Pipette Tips (Ultra low retention, filtered) in 10 µL, 20 µL, 200 µL, and 1000 µL sizes | USA Scientific | #1181-3810; #1180-1810; #1180-8810; #1182-1830 | |
Tricaine-S (MS 222) | Syndel | Tricaine10G | Syndel is an FDA-approved provider for pharmaceutical grade Tricaine |
TRIS, 1 M, pH 8.0 | VWR | E199-500 mL | |
Wide Bore Pipet Tips | Axygen | T-1005-WB-C |