Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Isolierung von Kernen aus den Gehirnen des kurzlebigen Wirbeltiermodells Nothobranchius furzeri für nachgeschaltete Anwendungen wie Einzelkern-RNA-Sequenzierung oder Einzelkern-Assay für Transposase-zugängliches Chromatin mit Sequenzierung (ATAC-seq).
Die Untersuchung der Gehirnalterung mit Einzelzellauflösung in Wirbeltiersystemen bleibt aufgrund von Kosten, Zeit und technischen Einschränkungen eine Herausforderung. Hier demonstrieren wir ein Protokoll zur Generierung von Einzelkern-RNA-Sequenzierungsbibliotheken (snRNA-seq) aus den Gehirnen des natürlich kurzlebigen afrikanischen Türkis-Killifischen Nothobranchius furzeri. Der afrikanische türkisfarbene Killifisch hat eine Lebensdauer von 4-6 Monaten und kann kostengünstig untergebracht werden, wodurch Kosten- und Zeitbarrieren für die Untersuchung der Gehirnalterung von Wirbeltieren reduziert werden. Es sind jedoch maßgeschneiderte Protokolle erforderlich, um Kerne von ausreichender Qualität für nachgeschaltete Einzelzellexperimente aus dem Gehirn junger und alter Fische zu isolieren. Hier demonstrieren wir ein empirisch optimiertes Protokoll zur Isolierung hochwertiger Kerne aus dem Gehirn erwachsener afrikanischer türkisfarbener Killifische, ein kritischer Schritt bei der Erzeugung hochwertiger Einzelkern-Omik-Bibliotheken. Darüber hinaus zeigen wir, dass die Schritte zur Reduzierung der kontaminierenden Hintergrund-RNA wichtig sind, um Zelltypen klar zu unterscheiden. Zusammenfassend zeigt dieses Protokoll die Machbarkeit der Untersuchung der Gehirnalterung in nicht-traditionellen Wirbeltiermodellorganismen.
Das Verständnis der Mechanismen der Alterung des Gehirns von Wirbeltieren ist entscheidend für die Behandlung altersbedingter neurodegenerativer Erkrankungen wie Alzheimer und Demenz1. Der Afrikanische Türkis-Killifisch (Nothobranchus furzeri) ist das kurzlebigste Wirbeltier, das in Gefangenschaft gezüchtet werden kann, und aufgrund seiner kurzen Lebensdauer und altersbedingten kognitiven Beeinträchtigung ist es ein ausgezeichnetes Gehirnalterungsmodell 2,3,4,5. In jüngster Zeit hat das Aufkommen von Einzelzell-“Omics” -Technologien, wie Single Nuclei RNA-seq (snRNA-seq) und Single Nuclei Assay für Transposase-zugängliches Chromatin mit Sequenzierung (snATAC-seq), es Forschern ermöglicht, das alternde Gehirn mit einer beispiellosen Auflösung zu befragen 6,7,8. Diese Methoden beruhen auf der Isolierung von Kernen, da die Wiederherstellung von Gehirnzellen wie Neuronen oft zu schwierig ist, um 6,7,8,9,10 zu isolieren. Die meisten veröffentlichten Kernisolierungsprotokolle sind jedoch für Säugetiermodellorganismen 11,12,13,14,15 optimiert. Da also derzeit ein ungedeckter Bedarf besteht, Hirnkerne im Killifisch als aufstrebenden neuen Modellorganismus im Bereich der Alternsforschung2 zu isolieren, ist das Ziel dieses Protokolls, eine Methode zur Isolierung hochwertiger Kerne aus gefrorenem Hirnkillifischgewebe zu etablieren.
Hier wird ein optimierter und robuster Workflow etabliert, der allgemein verfügbare Materialien verwendet, um hochwertige Kerne aus Killifischhirnen zu isolieren. Dieses Protokoll wurde von einem 10-fachen Genomik-Protokoll für Mausgehirne modifiziert, um den Gehirnen mit niedrigerem Myelingehalt von afrikanischen türkisfarbenen Killifischen Rechnung zu tragen, der Zerbrechlichkeit von gefrorenem Gewebe und der Notwendigkeit, den Gehalt an Umgebungsschmutz für sequenzierungsbezogene Anwendungen zu reduzieren16. Tatsächlich führen zuvor optimierte Protokolle für Säugetierhirngewebe17,18 zu schlechter Kernqualität (d.h. Überlyse) und/oder hohem Trümmergehalt, wenn sie auf gefrorenen Killifischen verwendet werden, was sie für die Verwendung mit snRNA-seq gemäß den Empfehlungen für Einzelkern-RNA-seq unter Verwendung von Mikrofluidik ungeeignet macht (ergänzende Abbildung 1).
Neben der Kernisolierung zeigen wir, wie die Qualität und Ausbeute der Kerne durch Mikroskopie und Durchflusszytometrie beurteilt werden kann. Dieser Artikel enthält Beispiele für optimale und suboptimale Ergebnisse und erläutert die Problembehandlung. Dieses Protokoll wurde für gefrorene Killifischhirne entwickelt und optimiert, kann aber auch ohne größere Modifikationen an frisch sezierten Killifischproben verwendet werden. Killifish Hirnkerne, die mit dieser Methode isoliert wurden, wurden für die Verwendung in Single Nucleus RNA-seq (snRNA-seq) als Downstream-Anwendung optimiert, sollten aber auch für den Einsatz in snATAC-seq und Bulk ATAC-seq geeignet sein.
Mit dem hier vorgestellten Protokoll lassen sich hochwertige Kerne aus Killifischhirnen reproduzierbar erzeugen. Dieses Protokoll musste speziell für das Killifisch-Gehirn entwickelt werden, da typische Säugetier-basierte Gehirnkern-Isolationsprotokolle, die auf Killifisch-Gehirne angewendet wurden, durchweg zu einer schlechten Kernqualität in unseren Händen führten. Wir vermuten, dass dies auf den geringeren relativen Myelingehalt des Killifisch-Gehirns im Vergleich zu ihren Säugetier-Gegenstücken zurückzuführen ist, die als Reaktion auf die rauen Bedingungen, die für die Lyse von Säugetier-Gehirnzellen erforderlich sind, lysieren und verklumpen würden. Dieses Protokoll ist ein Fortschritt in den Bereichen Alterung und Killifische, da es die Erforschung der Gehirnalterung auf Einzelzellebene in einem kostengünstigen und zeiteffektiven Modell der Gehirnalterung von Wirbeltieren erleichtert.
Dieses Protokoll ist robust gegenüber frischen oder gefrorenen Proben, obwohl man bei der Verwendung von frischem oder gefrorenem Gewebe die nachgeschalteten Anwendungen berücksichtigen muss. Gefrorenes Gewebe ist oft praktisch, da es monatelang gesammelt und gelagert werden kann, während Proben gesammelt werden. Solche Proben können sicher für Anwendungen wie snRNA-seq verwendet werden. Das Einfrieren von Proben kann jedoch die Kernstruktur und damit die Fähigkeit zur genauen Messung der Chromatinlandschaft durch ATAC-seq21 stören. Daher wird für nachgelagerte Anwendungen wie Bulk-ATAC-seq oder snATAC-seq empfohlen, frisch sezierte Gehirne anstelle von gefrorenen Gehirnen zu verwenden. Da alle Schritte nach der Gehirnhomogenisierung parallel durchgeführt werden können, ist dieses Protokoll außerdem für den Betrieb mehrerer Proben in einem angemessenen Zeitrahmen geeignet, wodurch der RNA-Abbau durch längere Inkubation auf Eis begrenzt wird.
Darüber hinaus ist es unerlässlich, Puffer frisch (innerhalb von Stunden) nach der Kernextraktion vorzubereiten. Wir haben festgestellt, dass sowohl Reinigungsmittel als auch BSA unmittelbar vor Beginn des Protokolls zu den Puffern hinzugefügt werden müssen. Puffer, die nur Salze (PBS, NaCl usw.) enthalten, können als Konzentrate hergestellt, sterilisiert (0,22 μm) und unbegrenzt bei Raumtemperatur gelagert werden. BSA-Stammlösungen können innerhalb weniger Tage nach der Kernextraktion (wenn sie aus einem Pulver hergestellt werden) hergestellt, sterilisiert und bei 4 °C gelagert werden, sollten jedoch den in diesem Protokoll verwendeten Puffern immer unmittelbar vor der Durchführung des Protokolls zugesetzt werden. Wir empfehlen jedoch, BSA-Lösungen am Tag des Protokolls vorzubereiten. Wenn Sie vorgefertigte BSA-Lösungen von Drittanbietern verwenden, wird empfohlen, frische, ungeöffnete Flaschen zu verwenden. Die Verwendung von frischem BSA führt im Allgemeinen zu einem geringeren Schmutzgehalt in den Zellkernvorbereitungen.
Unabhängig davon, ob frische oder gefrorene Proben als Input verwendet werden, ist es wichtig, die Kernqualität nach der Kernisolierung zu beurteilen. Obwohl dieses Protokoll speziell entwickelt wurde, um Überlyse zu vermeiden, ist dies die häufigste Ursache für den Verlust der Kernqualität. Die Überlyse kann durch zu viel Zeit im Lysepuffer, eine zu raue Handhabung der Kerne wie übermäßiges Pipettieren mit einer Standardpipettenspitze oder eine übermäßige Zeitspanne zwischen der Kernisolierung und nachgeschalteten Anwendungen (>1 h) entstehen. Überlysierte Kerne haben oft beschädigte Kernperipherien, die DNA austreten und Verklumpungen verursachen (Abbildung 2B). Dies wird zu einer erhöhten Anzahl von Multiplets führen und Hintergrundnukleinsäuren beitragen, die nachgelagerte Anwendungen, insbesondere snRNA-seq, stören. Beide Eigenschaften können nach Kernisolierung mikroskopisch beurteilt werden. Wenn eine übermäßige Kernverklumpung beobachtet wird, empfehlen wir, die Inkubation im Lyseschritt zu verkürzen, um die Wahrscheinlichkeit einer Überlyse zu verringern. Als alternative Methode zur Erhöhung der Nuklei-Singlets kann die fluoreszenzunterstützte Zellsortierung (FACS) verwendet werden, um Singlets stromabwärts dieses Protokolls anzureichern. Wir stellen jedoch fest, dass bei der Arbeit mit bereits fragilen Kernen aus gefrorenem Gewebe die während der Sortierung auftretende Scherspannung zu einem erhöhten Kernbruch und damit zu einer erhöhten Umgebungs-RNA / DNA führen kann. Darüber hinaus stellen wir fest, dass die Zeit, die benötigt wird, um eine FACS-Ertragssortierung für Kerne durchzuführen, wenn mehrere Proben verarbeitet werden, erfordern würde, dass alle Kernproben stundenlang auf Eis bleiben, während andere Proben sortiert werden. Daher könnten längere Wartezeiten bei der parallelen Verarbeitung mehrerer Proben mit dem FACS-Ansatz wahrscheinlich auch zu einer insgesamt reduzierten Kernqualität führen und das Risiko eines RNA-Abbaus erhöhen. Wenn also FACS für eine reduzierte Doublet-Rate gewünscht wird, empfehlen wir, den Schmutzgehalt nach der Ausbeutesortierung erneut zu überprüfen und eine mögliche reduzierte RNA-Qualität für Einzelzell-RNA-seq-Anwendungen als möglichen Vorbehalt zu berücksichtigen.
Eine genaue Schätzung der Kernzahl und des Singulettanteils ist für fast alle nachgeschalteten “Omics”-Anwendungen unerlässlich und von größter Bedeutung. Aufgrund der Fähigkeit, Kerne einfach nach Größe zu toren und zu zählen, ist die Durchflusszytometrie die genaueste Methode zum Zählen von Kernen, die wir bewertet haben. Alternativ kann man Zellzähler mit Zellzählern wie Invitrogens Countess 2 FL Automated Cell Counter oder dem DeNovix CellDrop Automated Cell Counter quantifizieren. Zu beachten ist, dass Invitrogens Countess 2 FL Automated Cell Counter und in viel geringerem Maße der DeNovix dazu neigen, die Anzahl der Kerne zu überschätzen, indem sie Trümmer als Kerne zählen, was bedeutet, dass ein manuelles Größengating erforderlich sein kann. Darüber hinaus ermöglicht das Durchflusszytometer eine einfache Beurteilung der Reinheit der Kerne. Man kann das relative Verhältnis von Singulett- und Multipletkernen auf eine quantitative Weise erkennen, die durch Mikroskopie schwierig ist. Dies ist für snRNA-seq und snATAC-seq von entscheidender Bedeutung, da diese Protokolle unter einem Überschuss an Multiplet-Proben leiden, die von nachgelagerten Analysen ausgeschlossen werden müssen. Neben Multipleten kann der relative Anteil von “Trümmern” (fragmentierte Kerne, Zelltrümmer) durch Durchflusszytometrie quantifiziert werden und muss relativ gering sein, da dieses Material oft kontaminierende Nukleinsäuren enthält, die ein Hintergrundsignal und korrumpierende Einzelkern-“Omics”-Daten beitragen können.
Wie bei zuvor beschriebenen Kernisolierungsprotokollen können die Anteile der Zelltypen im ursprünglichen Gewebe in der Zellkernvorbereitung19 nicht originalgetreu rekapituliert werden und sollten daher mit Vorsicht interpretiert werden. Wie alle Teleosts haben afrikanische türkisfarbene Killifische kernhaltige Erythrozyten, von denen erwartet wird, dass sie auch in der Kernvorbereitung vertreten sind. Diese Kerne können in snRNA-seq- und snATAC-seq-Datensätzen durch die höhere Expression/Zugänglichkeit von Hämoglobingenen identifiziert und rechnerisch ausgeschlossen werden, falls gewünscht.
The authors have nothing to disclose.
Einige Panels wurden mit BioRender.com generiert. Diese Arbeit in unserem Labor wurde durch das NIA T32 AG052374 Postdoctoral Training Grant an B.T., ein Stipendium der Simons Foundation im Rahmen der Simons Collaboration for Plasticity in the Aging Brain, ein Pilotstipendium der Navigage Foundation und ein Hanson-Thorell Family Award an B.A.B.
0.4% Trypan Blue solution | Gibco | 15250061 | |
10x PBS | Bioland | PBS01-03 | |
15 mL Conicle Centrifuge Tube | VWR | 89039-664 | |
2 mL Tissue Grinder | Kimble | 885300-0002 | Dounce Homogenizer |
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube | Falcon | 352054 | |
5M Sodium Chloride, Molecular Biology Grade | Promega | V4221 | |
autoMACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | This corresponds to 1x PBS pH 7.2, 2 mM EDTA (used for flow cytometry) |
Debris Removal Solution | Miltenyi Biotec | 130-109-398 | |
DNA LoBInd Tube | Eppendorf | 22431021 | |
Echo Revolve microscope (fitted with 60x objective) | Echo | NA | No catalog number; Used to visually inspect nuclei. |
Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes, 5 mL | Falcon | 352052 | FACS tube |
FLOWMI Cell Strainers, 40 μM | SP Bel-Art | 136800040 | Referred to as on-tip filters in Protocol |
Hydrochloric Acid | Sigma-Alrdich | 258146-500 mL | Used to lower TRIS pH from 8.0 to 7.4 |
Leica EZ4 dissecting scope | Leica | NA | No catalog number |
MACS BSA stock solution | Miltenyi Biotec | 130091376 | |
MACS SmartStrainers (70 μM) | Miltenyi Biotec | 130-110-916 | |
MACSQuant Analyzer 10 Flow Cytometer | Miltenyi Biotec | NA | No catalog number |
Magnesium Chloride, Hexahydrate, Molecular Biology Grade (Powder) | Millipore | 442611 | |
Megafuge 16R Centrifuge | ThermoScientific | 75003629 | |
Micro Cover Glass | VWR | 48393081 | |
Micro Slides Superfrost Plus | VWR | 48311-703 | |
Nonidet P-40 Substitute | Roche | (Roche) 11332473001/ Catalog: 983739 P Code: -102368106 (Sigma Aldrich) | |
NP-40 Surfact-Amps Detergent Solution | ThermoFisher | 85124 | |
Nuclease-Free HyPure Molecular Biology Grade Water | HyClone | SH30538.02 | |
NxGen RNase Inhibitor (50,000 U) | Lucigen | 30281-2 | |
Propidium Iodide solution | MBL | FP00010020 | |
PureBlu DAPI Nuclear Staining Dye | Biorad | 1351303 | |
TipOne RPT Pipette Tips (Ultra low retention, filtered) in 10 µL, 20 µL, 200 µL, and 1000 µL sizes | USA Scientific | #1181-3810; #1180-1810; #1180-8810; #1182-1830 | |
Tricaine-S (MS 222) | Syndel | Tricaine10G | Syndel is an FDA-approved provider for pharmaceutical grade Tricaine |
TRIS, 1 M, pH 8.0 | VWR | E199-500 mL | |
Wide Bore Pipet Tips | Axygen | T-1005-WB-C |