نقدم هنا بروتوكولا لعزل النوى من أدمغة نموذج الفقاريات قصير العمر Nothobranchius furzeri للتطبيقات النهائية مثل تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة أو مقايسة النواة الواحدة للكروماتين الذي يمكن الوصول إليه بواسطة transposase مع التسلسل (ATAC-seq).
لا تزال دراسة شيخوخة الدماغ بدقة الخلية الواحدة في أنظمة الفقاريات صعبة بسبب التكلفة والوقت والقيود التقنية. هنا ، نوضح بروتوكولا لإنشاء مكتبات تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة (snRNA-seq) من أدمغة الفقاريات الأفريقية الفيروزية ذات العمر القصير بشكل طبيعي Nothobranchius furzeri. يبلغ عمر سمك الكيلي الفيروزي الأفريقي 4-6 أشهر ويمكن إيواؤه بطريقة فعالة من حيث التكلفة ، وبالتالي تقليل حواجز التكلفة والوقت لدراسة شيخوخة دماغ الفقاريات. ومع ذلك ، هناك حاجة إلى بروتوكولات مصممة خصيصا لعزل النوى ذات الجودة الكافية لتجارب الخلية الواحدة في اتجاه مجرى النهر من دماغ الأسماك الصغيرة والمسنين. هنا ، نعرض بروتوكولا محسنا تجريبيا لعزل النوى عالية الجودة من دماغ سمك كيليفيش الفيروزي الأفريقي البالغ ، وهي خطوة حاسمة في توليد مكتبات أوميك أحادية النوى عالية الجودة. علاوة على ذلك ، نوضح أن خطوات تقليل تلوث الحمض النووي الريبي في الخلفية مهمة للتمييز بوضوح بين أنواع الخلايا. باختصار ، يوضح هذا البروتوكول جدوى دراسة شيخوخة الدماغ في الكائنات الحية النموذجية غير التقليدية.
يعد فهم آليات شيخوخة دماغ الفقاريات أمرا بالغ الأهمية لمعالجة الأمراض التنكسية العصبية المرتبطة بالعمر مثل مرض الزهايمر والخرف1. كيليفيش الفيروز الأفريقي (Nothobranchus furzeri) هو أقصر الفقاريات عمرا التي يمكن تربيتها في الأسر ، وبسبب عمرها القصير وضعف الإدراك المرتبط بالعمر ، فهي نموذج ممتاز لشيخوخة الدماغ2،3،4،5. في الآونة الأخيرة ، سمح ظهور تقنيات “omics” أحادية الخلية ، مثل النواة المفردة RNA-seq (snRNA-seq) ومقايسة النوى المفردة للكروماتين الذي يمكن الوصول إليه بواسطة transposase مع التسلسل (snATAC-seq) ، للباحثين باستجواب الدماغ المسن بدقة غير مسبوقة6،7،8. تعتمد هذه الطرق على عزل النوى ، نظرا لأن استعادة خلايا الدماغ مثل الخلايا العصبية غالبا ما يكون صعبا للغاية لعزل6،7،8،9،10. ومع ذلك ، تم تحسين معظم بروتوكولات عزل النوى المنشورة للكائنات النموذجية للثدييات11،12،13،14،15. وبالتالي ، نظرا لوجود حاجة غير ملباة حاليا لعزل نوى الدماغ في killifish ككائن نموذجي جديد قادم في مجال أبحاث الشيخوخة2 ، فإن الهدف من هذا البروتوكول هو إنشاء طريقة لعزل النوى عالية الجودة من أنسجة killifish المخية المجمدة.
هنا ، يتم إنشاء سير عمل مبسط وقوي يستخدم المواد المتاحة بشكل شائع لعزل النوى عالية الجودة من أدمغة killifish. تم تعديل هذا البروتوكول من بروتوكول 10x Genomics لأدمغة الفئران لاستيعاب أدمغة محتوى المايلين المنخفض لسمك الكيلي الفيروزي الأفريقي ، وهشاشة الأنسجة المجمدة ، والحاجة إلى تقليل محتوى الحطام المحيط للتطبيقات المتعلقة بالتسلسل16. في الواقع ، تؤدي البروتوكولات المحسنة سابقا لأنسجة دماغ الثدييات17,18 إلى جودة رديئة للنوى (أي الإفراط في التحلل) و / أو محتوى حطام مرتفع عند استخدامها على أدمغة أسماك الكيلي المجمدة ، مما يجعلها غير مناسبة للاستخدام مع snRNA-seq وفقا لتوصيات النوى المفردة RNA-seq باستخدام الموائع الدقيقة (الشكل التكميلي 1).
بالإضافة إلى عزل النوى ، نوضح كيفية تقييم جودة النوى والعائد عن طريق الفحص المجهري وقياس التدفق الخلوي. توفر هذه المقالة أمثلة على كل من النتائج المثلى ودون المثلى وتناقش استكشاف الأخطاء وإصلاحها. تم تصميم هذا البروتوكول وتحسينه لأدمغة سمك الكيلي المجمدة ولكن يمكن استخدامه أيضا دون تعديلات كبيرة على عينات سمك الكيلي التي تم تشريحها حديثا. تم تحسين نوى دماغ Killifish المعزولة باستخدام هذه الطريقة للاستخدام في نواة واحدة RNA-seq (snRNA-seq) كتطبيق نهائي ، ولكن يجب أيضا أن تكون قابلة للاستخدام في snATAC-seq و ATAC-seq السائبة.
يمكن استخدام البروتوكول المقدم هنا لتوليد نوى عالية الجودة من أدمغة killifish. كان لا بد من تصميم هذا البروتوكول خصيصا لدماغ killifish حيث أدت بروتوكولات عزل نوى الدماغ النموذجية القائمة على الثدييات المطبقة على أدمغة killifish باستمرار إلى ضعف جودة النوى في أيدينا. نشك في أن هذا يرجع إلى انخفاض محتوى المايلين النسبي في دماغ killifish مقارنة بنظرائهم في الثدييات ، والتي من شأنها أن تتحلل وتتجمع استجابة للظروف القاسية المطلوبة لتحلل خلايا دماغ الثدييات. هذا البروتوكول هو تقدم في مجالات الشيخوخة و killifish لأنه يسهل استكشاف شيخوخة الدماغ على مستوى الخلية الواحدة في نموذج فعال من حيث التكلفة والوقت لشيخوخة دماغ الفقاريات.
هذا البروتوكول قوي للعينات الطازجة أو المجمدة ، على الرغم من أنه يجب على المرء أن يأخذ في الاعتبار التطبيقات النهائية عند استخدام الأنسجة الطازجة أو المجمدة. غالبا ما تكون الأنسجة المجمدة مريحة حيث يمكن جمعها وتخزينها لعدة أشهر أثناء جمع العينات. يمكن استخدام هذه العينات بأمان لتطبيقات مثل snRNA-seq. ومع ذلك ، قد تؤدي عينات التجميد إلى تعطيل البنية النووية وبالتالي القدرة على قياس مشهد الكروماتين بدقة بواسطة ATAC-seq21. وبالتالي ، بالنسبة للتطبيقات النهائية مثل ATAC-seq السائبة أو snATAC-seq ، يوصى باستخدام أدمغة تشريح طازجة بدلا من العقول المجمدة. بالإضافة إلى ذلك ، نظرا لأنه يمكن إجراء جميع الخطوات بعد تجانس الدماغ بالتوازي ، فإن هذا البروتوكول قابل لتشغيل عينات متعددة في إطار زمني معقول ، وبالتالي الحد من تدهور الحمض النووي الريبي الناجم عن الحضانة المطولة على الجليد.
علاوة على ذلك ، من الضروري تحضير مخازن مؤقتة طازجة (في غضون ساعات) من إجراء استخراج النوى. وجدنا أنه يجب إضافة المنظفات وكذلك BSA إلى المخازن المؤقتة مباشرة قبل بدء البروتوكول. يمكن صنع المخازن المؤقتة التي تحتوي على أملاح فقط (PBS ، NaCl ، إلخ) كمركزات ، وتعقيمها بالمرشح (0.22 ميكرومتر) ، وتخزينها إلى أجل غير مسمى في درجة حرارة الغرفة. يمكن تحضير محاليل مخزون BSA وتعقيمها وتخزينها عند 4 درجات مئوية في غضون أيام من استخراج النوى (إذا تم تحضيرها من مسحوق) ولكن يجب دائما إضافتها إلى المخازن المؤقتة المستخدمة في هذا البروتوكول مباشرة قبل إجراء البروتوكول. ومع ذلك ، نوصي بإعداد حلول BSA في يوم البروتوكول. في حالة استخدام حلول BSA مسبقة الصنع من طرف ثالث ، ينصح باستخدام زجاجات جديدة غير مفتوحة. يؤدي استخدام BSA الطازج بشكل عام إلى انخفاض محتوى الحطام في تحضيرات النوى.
سواء تم استخدام العينات الطازجة أو المجمدة كمدخلات ، فمن المهم تقييم جودة النوى بعد عزل النوى. على الرغم من أن هذا البروتوكول مصمم خصيصا لتجنب الإفراط في التحلل ، إلا أن هذا هو السبب الأكثر شيوعا لفقدان جودة النوى. قد ينتج التحلل المفرط عن قضاء الكثير من الوقت في المخزن المؤقت للتحلل ، أو التعامل القاسي المفرط مع النوى مثل السحب المفرط بطرف ماصة التجويف القياسي ، أو مقدار مفرط من الوقت المستغرق بين عزل النوى والتطبيقات النهائية (>1 ساعة). غالبا ما تكون النوى المفرطة في التلف في الأطراف النووية ، والتي تسرب الحمض النووي وتسبب التكتل (الشكل 2 ب). سيؤدي ذلك إلى زيادة عدد المضاعفات والمساهمة في الأحماض النووية الخلفية التي ستتداخل مع التطبيقات النهائية ، وخاصة snRNA-seq. يمكن تقييم كلتا الصفتين عن طريق الفحص المجهري بعد عزل النوى. إذا لوحظ تكتل نووي مفرط ، نوصي بمحاولة تقصير حضانة خطوة التحلل لتقليل فرصة الإفراط في التحلل. كطريقة بديلة لزيادة مفردات النوى ، يمكن استخدام فرز الخلايا بمساعدة التألق (FACS) لإثراء المفردات في اتجاه مجرى هذا البروتوكول. ومع ذلك ، نلاحظ أنه عند العمل مع نوى هشة بالفعل من الأنسجة المجمدة ، قد يؤدي إجهاد القص الذي يحدث أثناء الفرز إلى زيادة التمزق النووي وبالتالي زيادة الحمض النووي الريبي / الحمض النووي المحيط. بالإضافة إلى ذلك ، نلاحظ أن الوقت اللازم لتشغيل فرز عائد FACS للنوى عند معالجة عينات متعددة سيتطلب بقاء جميع عينات النوى على الجليد لساعات ، بينما يتم فرز العينات الأخرى. وبالتالي ، فإن زيادة أوقات الانتظار عند معالجة عينات متعددة بالتوازي مع نهج نظام مراقبة الأصول الميدانية يمكن أن تؤدي أيضا إلى انخفاض جودة النوى بشكل عام وزيادة خطر تدهور الحمض النووي الريبي. ومن ثم، إذا كان نظام مراقبة الأصول الميدانية مرغوبا فيه بالنسبة لانخفاض معدل الازدواج، فإننا نوصي بفحص محتوى الحطام مرة أخرى بعد فرز الغلة وأن تؤخذ في الاعتبار إمكانية انخفاض جودة الحمض النووي الريبي بالنسبة لتطبيقات الحمض النووي الريبي أحادي الخلية كتحذير محتمل.
يعد التقدير الدقيق لعدد النوى ونسبة المفردة أمرا ضروريا لجميع تطبيقات “omics” النهائية تقريبا وهو ذو أهمية قصوى. نظرا للقدرة على بوابة النوى وعدها بسهولة حسب الحجم ، فإن قياس التدفق الخلوي هو الطريقة الأكثر دقة لحساب النوى التي قمنا بتقييمها. بدلا من ذلك ، يمكن للمرء تحديد النوى باستخدام عدادات الخلايا مثل عداد الخلايا الآلي Countess 2 FL من Invitrogen أو عداد الخلايا الآلي DeNovix CellDrop. تجدر الإشارة إلى أن عداد الخلايا الآلي Countess 2 FL من Invitrogen ، وإلى حد أقل بكثير DeNovix ، يميلان إلى المبالغة في تقدير عدد النوى عن طريق حساب الحطام كنوى ، مما يعني أن بوابة الحجم اليدوية قد تكون مطلوبة. علاوة على ذلك ، يسمح مقياس التدفق الخلوي للمرء بتقييم نقاء النوى بسهولة. يمكن للمرء أن يميز النسبة النسبية للنوى المفردة مقابل النوى المتعددة بطريقة كمية يصعب إجراؤها بواسطة الفحص المجهري. وهذا أمر حيوي بالنسبة ل snRNA-seq و snATAC-seq ، لأن هذين البروتوكولين سيعانيان من فائض في العينات المتعددة ، والتي يجب استبعادها من التحليلات النهائية. بالإضافة إلى المضاعفات ، يمكن قياس النسبة النسبية ل “الحطام” (النوى المجزأة ، الحطام الخلوي) عن طريق قياس التدفق الخلوي ويجب أن تكون منخفضة نسبيا ، لأن هذه المادة غالبا ما تحتوي على أحماض نووية ملوثة يمكن أن تسهم في إشارة خلفية وبيانات “omics” أحادية النواة الفاسدة.
كما هو الحال مع بروتوكولات عزل النوى الموصوفة سابقا ، قد لا يتم تلخيص نسب أنواع الخلايا في الأنسجة الأصلية بأمانة في إعداد النوى19 ، وبالتالي يجب تفسيرها بحذر. تجدر الإشارة ، مثل جميع teleosts ، يحتوي سمك كيليفيش الفيروزي الأفريقي على كريات الدم الحمراء ذات النواة ، والتي من المتوقع أيضا أن يتم تمثيلها في إعداد النوى. يمكن تحديد هذه النوى في مجموعات بيانات snRNA-seq و snATAC-seq من خلال التعبير العالي / إمكانية الوصول إلى جينات الهيموجلوبين ويمكن استبعادها حسابيا إذا رغبت في ذلك.
The authors have nothing to disclose.
تم إنشاء بعض اللوحات باستخدام BioRender.com. تم دعم هذا العمل في مختبرنا من خلال منحة تدريب ما بعد الدكتوراه NIA T32 AG052374 إلى BT ، ومنحة من مؤسسة Simons كجزء من تعاون Simons من أجل اللدونة في دماغ الشيخوخة ، ومنحة تجريبية من مؤسسة Navigage ، وجائزة عائلة Hanson-Thorell إلى B.A.B.
0.4% Trypan Blue solution | Gibco | 15250061 | |
10x PBS | Bioland | PBS01-03 | |
15 mL Conicle Centrifuge Tube | VWR | 89039-664 | |
2 mL Tissue Grinder | Kimble | 885300-0002 | Dounce Homogenizer |
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube | Falcon | 352054 | |
5M Sodium Chloride, Molecular Biology Grade | Promega | V4221 | |
autoMACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | This corresponds to 1x PBS pH 7.2, 2 mM EDTA (used for flow cytometry) |
Debris Removal Solution | Miltenyi Biotec | 130-109-398 | |
DNA LoBInd Tube | Eppendorf | 22431021 | |
Echo Revolve microscope (fitted with 60x objective) | Echo | NA | No catalog number; Used to visually inspect nuclei. |
Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes, 5 mL | Falcon | 352052 | FACS tube |
FLOWMI Cell Strainers, 40 μM | SP Bel-Art | 136800040 | Referred to as on-tip filters in Protocol |
Hydrochloric Acid | Sigma-Alrdich | 258146-500 mL | Used to lower TRIS pH from 8.0 to 7.4 |
Leica EZ4 dissecting scope | Leica | NA | No catalog number |
MACS BSA stock solution | Miltenyi Biotec | 130091376 | |
MACS SmartStrainers (70 μM) | Miltenyi Biotec | 130-110-916 | |
MACSQuant Analyzer 10 Flow Cytometer | Miltenyi Biotec | NA | No catalog number |
Magnesium Chloride, Hexahydrate, Molecular Biology Grade (Powder) | Millipore | 442611 | |
Megafuge 16R Centrifuge | ThermoScientific | 75003629 | |
Micro Cover Glass | VWR | 48393081 | |
Micro Slides Superfrost Plus | VWR | 48311-703 | |
Nonidet P-40 Substitute | Roche | (Roche) 11332473001/ Catalog: 983739 P Code: -102368106 (Sigma Aldrich) | |
NP-40 Surfact-Amps Detergent Solution | ThermoFisher | 85124 | |
Nuclease-Free HyPure Molecular Biology Grade Water | HyClone | SH30538.02 | |
NxGen RNase Inhibitor (50,000 U) | Lucigen | 30281-2 | |
Propidium Iodide solution | MBL | FP00010020 | |
PureBlu DAPI Nuclear Staining Dye | Biorad | 1351303 | |
TipOne RPT Pipette Tips (Ultra low retention, filtered) in 10 µL, 20 µL, 200 µL, and 1000 µL sizes | USA Scientific | #1181-3810; #1180-1810; #1180-8810; #1182-1830 | |
Tricaine-S (MS 222) | Syndel | Tricaine10G | Syndel is an FDA-approved provider for pharmaceutical grade Tricaine |
TRIS, 1 M, pH 8.0 | VWR | E199-500 mL | |
Wide Bore Pipet Tips | Axygen | T-1005-WB-C |