Özet

Uso de pinzas ópticas duales y microfluídica para estudios de moléculas individuales

Published: November 18, 2022
doi:

Özet

La bioquímica visual de una sola molécula estudiada a través de cámaras microfluídicas se facilita enormemente utilizando barriles de vidrio, jeringas herméticas al gas, conexiones estables de tubos a células de flujo y eliminación de burbujas mediante la colocación de válvulas de conmutación entre las jeringas y el tubo. El protocolo describe trampas ópticas duales que permiten la visualización de transacciones de ADN e interacciones intermoleculares.

Abstract

La bioquímica visual es una técnica poderosa para observar las propiedades estocásticas de enzimas individuales o complejos enzimáticos que están oscurecidos en el promedio que tiene lugar en los estudios de fase masiva. Para lograr la visualización, las pinzas ópticas duales, donde una trampa es fija y la otra es móvil, se enfocan en un canal de una cámara microfluídica multiflujo colocada en el escenario de un microscopio de fluorescencia invertida. Las pinzas ópticas atrapan moléculas individuales de ADN marcado fluorescentemente y el flujo de fluido a través de la cámara y más allá de las perlas atrapadas, estira el ADN a forma B (bajo una fuerza mínima, es decir, 0 pN) con el ácido nucleico que se observa como una cuerda blanca contra un fondo negro. Las moléculas de ADN se mueven de una corriente a la siguiente, traduciendo la etapa perpendicular al flujo para permitir el inicio de reacciones de manera controlada. Para lograr el éxito, los dispositivos microfluídicos con canales ópticamente claros se acoplan a jeringas de vidrio que se mantienen en su lugar en una bomba de jeringa. Los resultados óptimos utilizan conectores permanentemente unidos a la celda de flujo, tubos que son mecánicamente rígidos y químicamente resistentes, y que están conectados a válvulas de conmutación que eliminan las burbujas que prohíben el flujo laminar.

Introduction

La capacidad de visualizar las interacciones proteína-ADN a nivel de molécula única y en tiempo real ha proporcionado información significativa sobre la estabilidad del genoma 1,2. Además de trabajar con moléculas individuales de ADN de una en una, la capacidad de ver las transacciones entre moléculas individuales cercanas proporciona información adicional 3,4,5. La manipulación de moléculas de ADN adicionales requiere tanto trampas ópticas adicionales como células de flujo microfluídico multicanal de alta calidad6.

Hay varios métodos disponibles para generar más de una trampa óptica. Estos incluyen espejos de escaneo galvanómetro, moduladores ópticos acústicos y óptica difractiva, que generan pinzas ópticas holográficas 4,7,8,9. A menudo, los espejos de escaneo y los moduladores ópticos acústicos producen trampas de tiempo compartido. En la configuración descrita aquí, el haz de un solo láser Nd: YAG se divide en la polarización, y luego los espejos de escaneo láser del galvanómetro controlan la posición de lo que se denomina la trampa móvil (Figura 1) 4. Para facilitar el posicionamiento de espejos y filtros para dirigir el haz de atrapamiento a la abertura posterior del objetivo del microscopio, se utiliza un láser HeNe. Esto facilita la alineación general, ya que el haz HeNe es visible a simple vista, mientras que los rayos infrarrojos no lo son. El haz HeNe también es más seguro para trabajar con lo que hace que el posicionamiento de los espejos y otros componentes sea menos estresante. Inicialmente, la trayectoria del haz para este láser está separada del haz de 1064 nm, pero se introduce en la misma trayectoria del haz y luego en el objetivo del microscopio. Una vez que se logra la alineación física, se realiza el posicionamiento del haz de 1064 nm en la parte superior del haz HeNe y esto se facilita mediante el uso de un visor infrarrojo y varias herramientas de imágenes de haz para visualizar la posición y la calidad del haz. Luego, se introduce el expansor de haz y el haz infrarrojo expandido resultante se alinea en la abertura posterior del objetivo. Finalmente, se retira el objetivo y la potencia en cada haz polarizado se mide y ajusta utilizando placas de onda λ/2 para que sea igual (Figura 1C). Las mediciones de potencia también se realizan una vez que se devuelve el objetivo y, por lo general, hay una pérdida de potencia del 53%. Sin embargo, hay suficiente potencia para formar trampas ópticas fijas y móviles estables en el plano focal (Figura 1D).

Para obtener imágenes de las transacciones de ADN, las células de flujo microfluídico desempeñan un papel clave, ya que permiten mediciones controladas a nivel de molécula única con alta resolución espacial y temporal (Figura 2). El término microfluídico se refiere a la capacidad de manipular fluidos en uno o más canales con dimensiones que van desde 5-500 μm10,11. El término corriente se refiere al fluido real dentro de un canal y el canal se refiere al canal físico en el que se mueve una corriente o corrientes de fluido. El diseño de celda de flujo de un solo canal tiene un canal físico común donde se observan las reacciones y, por lo general, solo hay una corriente de fluido presente. Por lo tanto, estos diseños se conocen como células de flujo de flujo único. En contraste, las células de flujo múltiple se definen como un dispositivo microfluídico en el que dos o más canales de entrada convergen en un solo canal físico común (Figura 2A). Dentro del canal común, las corrientes de fluido que se originan en los canales individuales fluyen paralelas entre sí, y permanecen separadas con una mezcla mínima entre ellas debido a la difusión (Figura 2B). En la mayoría de las configuraciones experimentales, una sola bomba empuja fluidos en cada canal a la misma velocidad. Por el contrario, cuando se utiliza la dirección límite, tres o más bombas controladas independientemente empujan los fluidos a través de los canales. Sin embargo, cada bomba funciona a una velocidad diferente, pero el caudal neto en el canal común es constante12. Esto permite el intercambio rápido de los componentes del canal principal simplemente alterando la velocidad de la bomba.

Además del flujo laminar, otro factor crítico es el perfil de velocidad parabólica dentro de la corriente de fluido laminar. La velocidad de flujo más alta ocurre en el medio de la corriente y la más lenta ocurre junto a las superficies (Figura 2C)13. Se debe considerar que este perfil estira completamente una molécula de ADN que está unida a una cuenta sostenida en la corriente para una visualización precisa del ADN fluorescente y análisis precisos de una sola molécula. Aquí, el ADN se estira a la forma B y se mantiene en su lugar bajo 0 pN de fuerza. Para lograr esto, el enfoque de la posición de la trampa óptica debe ser a una posición de 10-20 μm de la superficie del cubreobjetos inferior (Figura 2D). Se debe tener cuidado para que la molécula de ADN no se estire más allá de la forma B, ya que esto puede inhibir las reacciones enzimáticas. En condiciones típicas de amortiguación, 1 μm = 3.000 pb de ADN14. Además, al atrapar 10-20 μm del cubreobjetos, el complejo de ADN se coloca lejos de la superficie, minimizando así las interacciones superficiales.

Se han utilizado muchos métodos para crear canales de dispositivos microfluídicos y estos se pueden hacer en el laboratorio o las células de flujo se pueden comprar de fuentes comerciales 6,15,16,17. Los materiales óptimos utilizados para construir las células de flujo deben ser mecánicamente rígidos, ópticamente transparentes con baja fluorescencia e impermeables a los disolventes orgánicos6. Con frecuencia, el vidrio flotado de borosilicato o sílice fundida se utilizan para proporcionar un entorno de flujo estable durante un tiempo prolongado que es adecuado para la captura óptica, la visualización y la detección de fuerza. Estos materiales también permiten el uso de solventes no acuosos (por ejemplo, metanol de grado espectrofotométrico) para simplificar la humectación de la superficie y la eliminación de burbujas de aire, y desnaturalizantes (por ejemplo, clorhidrato de guanidinio 6M) o detergentes para limpiar la celda de flujo. Finalmente, los métodos utilizados para introducir fluidos en las celdas de flujo varían desde complejos sistemas de bombas de vacío hasta bombas de una sola jeringa 14,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. En el enfoque descrito aquí, se utiliza una bomba de jeringa que puede acomodar hasta 10 jeringas (Figura 3A). Esto proporciona flexibilidad para usar celdas de flujo de un solo canal o celdas de flujo con múltiples canales de entrada. Aquí, se utiliza una celda de flujo de tres canales y se acopla a jeringas mantenidas en su lugar en la bomba de jeringa utilizando tubos de poli-éter-éter-cetona (PEEK) (Figura 3A-C). El flujo de fluidos es controlado por válvulas de conmutación de cuatro vías y, por lo tanto, sirven para minimizar la introducción de burbujas en la celda de flujo (Figura 3A, D). Además, se recomiendan las jeringas estancas al gas Hamilton que tienen paredes de vidrio rígido y émbolos recubiertos de politetrafluoroetileno (PTFE), ya que proporcionan un movimiento de émbolo excepcionalmente suave que es esencial para obtener un flujo suave14,27.

En el sistema experimental descrito, se han utilizado células de flujo con dos a cinco canales de entrada. El número de canales de entrada está dictado por el experimento que se está realizando. Para el estudio de RecBCD y Hop2-Mnd1, dos canales de corriente fueron suficientes14,28. Para la helicasa, la enzima se unió al extremo libre del ADN y se tradujo en una corriente que contiene magnesio y ATP para iniciar la translocación y el desenrollamiento. Para Hop2-Mnd1, el ADN atrapado ópticamente se tradujo en la corriente de fluido adyacente que contiene proteínas y amortiguador ± iones metálicos divalentes. El uso de células de flujo de tres canales permite atrapar el ADN en la corriente 1, traducir el ADN en la corriente 2 para permitir que ocurra la unión a las proteínas, y luego a la corriente 3 donde el ATP está presente, por ejemplo, para iniciar reacciones. Una variación de lo anterior es usar proteína marcada con fluorescencia en el canal 2, lo que hace que la corriente de fluido sea completamente blanca e impide la visualización del ADN. Cuando esta molécula se traduce en la corriente 3, tanto las proteínas como el ADN son ahora visibles cuando se inician las reacciones.

El uso de válvulas de conmutación de cuatro vías para controlar el flujo de fluido es un componente crítico del sistema para eliminar las burbujas en las celdas de flujo. Las burbujas son perjudiciales para el flujo estable de fluidos, ya que se contraen y expanden de manera impredecible, lo que resulta en cambios rápidos en la velocidad del flujo y la introducción de turbulencias. Cuando las válvulas se colocan entre las jeringas y el tubo de entrada, la trayectoria del flujo se desconecta cambiando la posición de la válvula cuando se cambian las jeringas. Cuando se coloca la nueva jeringa, el émbolo se puede presionar manualmente para expulsar >6 μL (el volumen muerto de la válvula) y esto elimina las burbujas casi por completo.

La fijación de conectores a las celdas de flujo es con frecuencia el paso limitante de la velocidad en el uso de la celda de flujo. Describimos el uso de dos tipos de conectores: extraíbles conocidos como press-fit y permanentes (conjuntos de nanopuertos). Los conectores extraíbles son fáciles de adherir a una celda de flujo y se pueden probar diferentes tipos de tubos flexibles además del PTFE recomendado con estos conectores. Esta es una forma rápida y rentable de probar tubos y conectores sin sacrificar celdas de flujo de vidrio más caras. En contraste, los ensamblajes de nanopuertos están unidos permanentemente, soportan presiones de hasta 1,000 psi y, en nuestras manos, su uso está restringido a tubos PEEK de diferentes diámetros. Esto no es una desventaja, ya que preferiblemente se utiliza un tubo PEEK. Una sola celda de flujo de vidrio con ensamblajes permanentes unidos se puede reutilizar durante más de 1 año con un uso cuidadoso.

Protocol

1. Alineación y prueba de trampas láser con perlas de poliestireno NOTA: Para la configuración, consulte la Figura 1A,B. PRECAUCIÓN: El experimentador debe usar gafas protectoras adecuadas o gafas de seguridad láser durante la alineación del rayo láser. Como el sistema de pinzas ópticas descrito en este documento utiliza haces HeNe e IR, se requieren dos juegos separados de cristalería de segurid…

Representative Results

La prueba inicial de la alineación y resistencia de la trampa se realiza con perlas de poliestireno no fluorescentes de 1 μm. Dado que la mayor parte de la investigación realizada en el laboratorio utiliza fluorescencia, probamos aún más la resistencia de la trampa utilizando perlas de poliestireno verde dragón de 1 μm (Figura 1D, E). Posteriormente, el trabajo cambia a la captura óptica de complejos ADN-perla donde el ADN se tiñe con el colorante intercalante bis-Y…

Discussion

El montaje cuidadoso del sistema de flujo es fundamental para el resultado exitoso de los experimentos 4,6. Uno de los aspectos más desafiantes del protocolo es la fijación de conectores a la superficie del vidrio. Para ello, utilizamos los dos enfoques siguientes: conectores de tubos de ajuste a presión y conjuntos de nanopuertos. Los conectores de ajuste a presión se adhieren fácilmente al vidrio seguido de empujar el tubo de PTFE en los orificios preforma…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

La investigación en el laboratorio de Bianco está respaldada por las subvenciones de los NIH GM100156 y GM144414 a P.R.B.

Materials

100x objective Leica 506318 or 506038 Oil immersion lenses; Imaging and optical trapping only; Plan APO objectives optimized for fluorescence imaging
10X Objective Leica 506263 Used to locate laser beams spots during alignment; to find focus and X-Y position in flow cell
1 mm fluorescent beads Bangs Labs FSDG004 Used for tap performance, focal position determination
1 mm polystyrene beads Bangs Labs CPO1004 Used for trap performance evaluation and binding to biotinylated molecules
63x objective Leica 506081 Used to locate laser beams spots during alignment and to find focus and X-y position in flow cell; can be used for optical trapping as it has an identical back aperture diameter to the 100X; oil immersion lens
Alignment laser Lumentum 1100 series 10mW HeNe laser that is visible to the naked eye that is used to position optics
Beam alignment camera Amscope MU303 A simple, inexpensive and software controlled camera for imaging of the beam position
Camera control and Image capture software Hamamatsu HCImage Coordinates activities of the Lambda DG4 with the camera to facilitate rapid wavelength switching
Camera; Orca flash 4 Hamamatsu c13440-20cu CCD camera for imaging of single-molecule experiments
C-mount for the beam alignment camera Spot imaging solutions DE50CMT Provides optimal positioning of the camera for imaging of laser beams during alignment
C-mount for the Orca Flash 4 camera Has a retainer ring to hold an IR blocking filter in place. This eliminates reflected IR beam from the optical traps and facilitates clearer imaging of trapped objects.
Cy5  fluorescence filter cube Semrock cy5-404a-lsc-zero Used in conjunction with Lambda DG4 to image Cy5 only
Fitc-Txred  fluorescence filter cube Semrock fitc/txred-2x-b-000 Used in conjunction with Lambda DG4 to image FITC and TXRed
Fluidics tubing Grace Bio 46004 PTFE tubing as an alternate to PEEK; works well on some flow cells. Can be used with PDMS flow cells or glass flow cells when Grace Bio fit tubing connectors are used
GFP fluorescence filter cube Semrock gfp-3035b-lsc-zero Used in conjunction with Lambda DG4 to image GFP only
Glass flow cells Translume Custom Clear flow channels for imaging (Fig. 2E)
Glass glue Loctite 233841 Securely and easily bonds Nanoport assemblies to glass flow cells
Glass/PDMS sandwich flow cells CIDRA Precision services Custom design Flow cells built according to your specifications; imaging channels are clear (Fig. 2C)
Hamilton Cleaning solution Hamilton 18311 Gentle but efficient cleaning solution for glass flow cells; does not bubble when used carefully
Illumination system Sutter Instrument Lamda DG4 Discontinued so recommend Lambda 721
Illumination system Sutter Instrument Lamda DG4 Discontinued so recommend Lambda 721
Image analysis software Media cybernetics Image Pro Premiere Analysis of images and single molecule tracking
Image analysis software Fiji/NIH Image/Image J Shareware Analysis of images and single molecule tracking
Image display card Melles Griot 06 DLA 001 Alternate product from Thorlabs: VRC5
Immersion oil Zeiss 444960 Immersol 518 F fluorescence free
Laser beam alignment tools Thor labs FMP05/M; dgo5-1500-h1; BHM1  Used to ensure beams are horizontal and at the correct height
Laser beam viewer Canadian Photonics labs IR 3150 Used to image IR beam spots on mirrors and  targets
Laser power meter Thor labs Measurement of laser output as well as trap strength
Laser safety glasses (HeNe) Thor labs LG7 or 8 Blocks >3 OD units of light of wavelengths >600 nm
Laser safety glasses (IR) Thor labs LG11 Blocks >7 OD units of light of wavelengths ³1000 nm
Mcherry  fluorescence filter cube Semrock mcherry-a-lsc-zero Used in conjunction with Lambda DG4 to image mcherry only
Microscope Leica DMIRE2 DIC port removed to accommodate Dichroic trapping/alignment mirror
Microscope control software  UCSF/shareware uManager Controls the microscope, permits focal alignment of objectives as well as stage control
Nanoport assembly IDEX N333 Connectors that are bonded to flow cells
Optical table support Thor Labs PA52502 Active isolation table support
Optics and lenses Solar TII Various Interference mirrors, telescopes and lenses custom designed for the system
PDMS flow cells ufluidix Custom Flow cells built according to your specifications; imaging channels are clear (Figs. 2B and D)
PEEK tubing IDEX 1532 Provides excellent connection to flow cells and switching valves
Pinkel fluorescence filter cube Semrock lf488/543/635-3x-a-000 Used in conjunction with Lambda DG4 to image multiple fluorophores rapidly
Press fit tubing connectors GraceBio 46003 Clear silicone connector with adhesive that binds well to glass
Scanning mirrors GSI Lumonics VM500 Used to provide control of the second optical trap. GSI Lumonics no longer exists. Similar mirrors can be purchased from Cambridge Scientific
Stage Leica
Stage micrometer Electron Microscopy Sciences 68042-08 Provides on screen ruler for positioning of the beam and system calibration
Switching valves IDEX V-101T Control direction of fluid flow and eliminate introduction of bubbles into flow cells
Syringe and valve manifold Machine shop None Custom built
Syringe pump Harvard Apparatus PHD 2000 Controls fluid flow through flow cells
Syringe pump software Harvard Apparatus 70-6000 Flow control provides seamless, programmable control of fluid flow
Syringes Hamilton 81320 Gas-tight, PTFE Luer Lock, glass barrels with Teflon-coated plungers
Table top Thor Labs T36H Optical table top or breadboard
Trapping laser Newport/Spectra Physics J-series; BL106C Nd:YAG laser; 1064 nm; 5W laser

Referanslar

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Bu Makaleden Alıntı Yapın
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