Özet

Uso di pinzette ottiche doppie e microfluidica per studi a singola molecola

Published: November 18, 2022
doi:

Özet

La biochimica visiva a singola molecola studiata attraverso camere microfluidiche è notevolmente facilitata utilizzando barili di vetro, siringhe a tenuta di gas, connessioni stabili di tubi alle celle di flusso ed eliminazione delle bolle posizionando valvole di commutazione tra le siringhe e i tubi. Il protocollo descrive due trappole ottiche che consentono la visualizzazione delle transazioni del DNA e delle interazioni intermolecolari.

Abstract

La biochimica visiva è una potente tecnica per osservare le proprietà stocastiche di singoli enzimi o complessi enzimatici che sono oscurati nella media che avviene negli studi in fase di massa. Per ottenere la visualizzazione, le pinzette ottiche doppie, in cui una trappola è fissa e l’altra è mobile, sono focalizzate in un canale di una camera microfluidica multi-flusso posizionata sul palco di un microscopio a fluorescenza invertita. Le pinzette ottiche intrappolano singole molecole di DNA marcato fluorescentmente e il fluido scorre attraverso la camera e oltre le perle intrappolate, allunga il DNA in forma B (sotto una forza minima, cioè 0 pN) con l’acido nucleico osservato come una stringa bianca su uno sfondo nero. Le molecole di DNA vengono spostate da un flusso all’altro, traslando lo stadio perpendicolarmente al flusso per consentire l’avvio delle reazioni in modo controllato. Per raggiungere il successo, i dispositivi microfluidici con canali otticamente trasparenti sono accoppiati a siringhe di vetro tenute in posizione in una pompa a siringa. I risultati ottimali utilizzano connettori legati in modo permanente alla cella di flusso, tubi meccanicamente rigidi e resistenti agli agenti chimici e collegati a valvole di commutazione che eliminano le bolle che impediscono il flusso laminare.

Introduction

La capacità di visualizzare le interazioni proteina-DNA a livello di singola molecola e in tempo reale ha fornito informazioni significative sulla stabilità del genoma 1,2. Oltre a lavorare con singole molecole di DNA una alla volta, la possibilità di visualizzare le transazioni tra singole molecole vicine fornisce ulteriori informazioni 3,4,5. La manipolazione di ulteriori molecole di DNA richiede sia trappole ottiche aggiuntive che celle a flusso microfluidico multicanale di alta qualità6.

Esistono diversi metodi disponibili per generare più di una trappola ottica. Questi includono specchi a scansione galvanometrica, modulatori ottici acustici e ottiche diffrattive, che generano pinzette ottiche olografiche 4,7,8,9. Spesso, specchi a scansione e modulatori ottici acustici producono trappole che multiproprietà. Nella configurazione qui descritta, il fascio di un singolo laser Nd: YAG viene diviso sulla polarizzazione, e quindi gli specchi di scansione laser galvanometrici controllano la posizione di quella che viene definita la trappola mobile (Figura 1) 4. Per facilitare il posizionamento di specchi e filtri per dirigere il fascio di intrappolamento verso l’apertura posteriore dell’obiettivo del microscopio, viene utilizzato un laser HeNe. Ciò rende più facile l’allineamento generale in quanto il fascio HeNe è visibile ad occhio nudo, mentre i raggi infrarossi non lo sono. Il fascio HeNe è anche più sicuro da lavorare rendendo il posizionamento di specchi e altri componenti meno stressante. Inizialmente, il percorso del fascio per questo laser è separato dal raggio di 1064 nm, ma viene introdotto nello stesso percorso del fascio e quindi nell’obiettivo del microscopio. Una volta raggiunto l’allineamento fisico, viene eseguito il posizionamento del fascio di 1064 nm sopra il fascio HeNe e questo è facilitato dall’uso di un visualizzatore a infrarossi e vari strumenti di imaging del fascio per visualizzare la posizione e la qualità del fascio. Quindi, viene introdotto l’espansore del fascio e il raggio infrarosso espanso risultante viene allineato sull’apertura posteriore dell’obiettivo. Infine, l’obiettivo viene rimosso e la potenza in ciascun fascio polarizzato viene misurata e regolata utilizzando piastre d’onda λ/2 per essere uguale (Figura 1C). Le misurazioni della potenza vengono eseguite anche una volta restituito l’obiettivo e in genere c’è una perdita di potenza del 53%. C’è, tuttavia, una potenza sufficiente per formare trappole ottiche fisse e mobili stabili nel piano focale (Figura 1D).

Per visualizzare le transazioni del DNA, le celle a flusso microfluidico svolgono un ruolo chiave in quanto consentono misurazioni controllate a livello di singola molecola con un’elevata risoluzione spaziale e temporale (Figura 2). Il termine microfluidica si riferisce alla capacità di manipolare fluidi in uno o più canali con dimensioni comprese tra 5-500 μm10,11. Il termine flusso si riferisce al fluido effettivo all’interno di un canale e il canale si riferisce al canale fisico in cui si muovono uno o più flussi di fluidi. Il design della cella di flusso a canale singolo ha un canale fisico comune in cui vengono osservate le reazioni e in genere è presente un solo flusso di fluido. Pertanto, questi progetti sono noti come celle di flusso a flusso singolo. Al contrario, le celle a flusso multi-stream sono definite come un dispositivo microfluidico in cui due o più canali di ingresso convergono in un singolo canale fisico comune (Figura 2A). All’interno del canale comune, i flussi fluidi che hanno origine dai singoli canali fluiscono paralleli l’uno all’altro e rimangono separati con una miscelazione minima tra loro che si verifica a causa della diffusione (Figura 2B). Nella maggior parte delle configurazioni sperimentali, una singola pompa spinge i fluidi in ciascun canale alla stessa velocità. Al contrario, quando viene utilizzato lo sterzo di confine, tre o più pompe a controllo indipendente spingono i fluidi attraverso i canali. Tuttavia, ogni pompa funziona a una velocità diversa, ma la portata netta nel canale comune è costante12. Ciò consente la rapida sostituzione dei componenti del canale principale semplicemente modificando la velocità della pompa.

Oltre al flusso laminare, un altro fattore critico è il profilo di velocità parabolica all’interno del flusso di fluido laminare. La velocità di flusso più elevata si verifica nel mezzo del flusso e la più lenta si verifica vicino alle superfici (Figura 2C)13. Questo profilo deve essere considerato per allungare completamente una molecola di DNA che è attaccata a una perla tenuta nel flusso per una visualizzazione precisa del DNA fluorescente e accurate analisi di singole molecole. Qui, il DNA è allungato in forma B e viene tenuto in posizione sotto 0 pN di forza. Per raggiungere questo obiettivo, la messa a fuoco della posizione della trappola ottica dovrebbe essere in una posizione di 10-20 μm dalla superficie inferiore del coperchio (Figura 2D). Bisogna fare attenzione in modo che la molecola di DNA non sia allungata oltre la forma B in quanto ciò può inibire le reazioni enzimatiche. In condizioni tampone tipiche, 1 μm = 3.000 bp di DNA14. Inoltre, intrappolando 10-20 μm dal vetrino, il complesso del DNA viene posizionato lontano dalla superficie, riducendo così al minimo le interazioni superficiali.

Molti metodi sono stati utilizzati per creare canali di dispositivi microfluidici e questi possono essere fatti in laboratorio o celle di flusso possono essere acquistati da fonti commerciali 6,15,16,17. I materiali ottimali utilizzati per costruire le celle di flusso devono essere meccanicamente rigidi, otticamente trasparenti con bassa fluorescenza e impermeabili ai solventi organici6. Spesso, il vetro float borosilicato o la silice fusa vengono utilizzati per fornire un ambiente di flusso stabile per un tempo prolungato adatto per l’intrappolamento ottico, la visualizzazione e il rilevamento della forza. Questi materiali consentono anche l’uso di solventi non acquosi (ad esempio, metanolo spettrofotometrico) per semplificare la bagnatura superficiale e la rimozione delle bolle d’aria e denaturanti (ad esempio, 6M guanidinium cloridrato) o detergenti per pulire la cella di flusso. Infine, i metodi utilizzati per introdurre fluidi nelle celle di flusso variano da complessi sistemi di pompe per vuoto a pompe a siringa singola 14,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. Nell’approccio qui descritto, viene utilizzata una pompa a siringa che può contenere fino a 10 siringhe (Figura 3A). Ciò offre la flessibilità di utilizzare celle di flusso a canale singolo o celle di flusso con più canali di ingresso. Qui, viene utilizzata una cella di flusso a tre canali che viene accoppiata a siringhe tenute in posizione sulla pompa a siringa utilizzando tubi in poli-etere-etere-chetone (PEEK) (Figura 3A-C). Il flusso dei fluidi è controllato da valvole di commutazione a quattro vie e serve quindi a ridurre al minimo l’introduzione di bolle nella cella di flusso (Figura 3A,D). Inoltre, si raccomandano siringhe a tenuta di gas Hamilton con pareti di vetro rigide e stantuffi rivestiti in politetrafluoroetilene (PTFE), in quanto forniscono un movimento eccezionalmente regolare dello stantuffo che è essenziale per ottenere un flusso regolare14,27.

Nel sistema sperimentale descritto sono state utilizzate celle di flusso con canali di ingresso da due a cinque. Il numero di canali di ingresso è dettato dall’esperimento in corso. Per lo studio di RecBCD e Hop2-Mnd1, due canali di flusso erano sufficienti14,28. Per l’elicasi, l’enzima è stato legato all’estremità libera del DNA e tradotto in un flusso contenente magnesio e ATP per avviare la traslocazione e lo svolgimento. Per Hop2-Mnd1, il DNA intrappolato otticamente è stato tradotto nel flusso fluido adiacente contenente proteine e tampone ± ioni metallici bivalenti. L’uso di cellule a flusso a tre canali consente di intrappolare il DNA nel flusso 1, tradurre il DNA nel flusso 2 per consentire il legame proteico e quindi di flusso 3 dove è presente ATP, ad esempio, per avviare reazioni. Una variazione di quanto sopra è quella di utilizzare proteine marcate con fluorescenza nel canale 2, che si traduce in un flusso fluido completamente bianco e preclude la visualizzazione del DNA. Quando questa molecola viene tradotta nel flusso 3, sia le proteine che il DNA sono ora visibili quando vengono avviate le reazioni.

L’uso di valvole di commutazione a quattro vie per controllare il flusso del fluido è un componente critico del sistema per eliminare le bolle nelle celle di flusso. Le bolle sono dannose per il flusso stabile del fluido in quanto si contraggono e si espandono in modi imprevedibili con conseguenti rapidi cambiamenti nella velocità del flusso e l’introduzione di turbolenza. Quando le valvole sono posizionate tra siringhe e tubi di ingresso, il percorso del flusso viene scollegato cambiando la posizione della valvola quando le siringhe vengono sostituite. Quando la nuova siringa viene posizionata, lo stantuffo può essere premuto manualmente in modo che vengano espulsi >6 μL (il volume morto della valvola) e questo elimina quasi completamente le bolle.

Il collegamento di connettori alle celle di flusso è spesso la fase limitante nell’uso delle celle di flusso. Descriviamo l’uso di due tipi di connettori: rimovibili noti come press-fit e permanenti (assemblaggi nanoport). I connettori rimovibili sono semplici da aderire a una cella di flusso e diversi tipi di tubi flessibili oltre al PTFE consigliato possono essere testati con questi connettori. Questo è un modo rapido ed economico per testare tubi e connettori senza sacrificare celle di flusso in vetro più costose. Al contrario, i gruppi nanoport sono fissati in modo permanente, resistono a pressioni fino a 1.000 psi, e, nelle nostre mani, il loro uso è limitato a tubi in PEEK di diversi diametri. Questo non è uno svantaggio in quanto viene preferibilmente utilizzato il tubo PEEK. Una singola cella di flusso in vetro con assemblaggi permanenti collegati può essere riutilizzata per più di 1 anno con un uso attento.

Protocol

1. Allineamento e test della trappola laser con perline di polistirolo NOTA: per l’installazione, fare riferimento alla Figura 1A,B. ATTENZIONE: Lo sperimentatore deve indossare occhiali protettivi appropriati o occhiali di sicurezza laser durante l’allineamento del raggio laser. Poiché il sistema di pinzette ottiche qui descritto utilizza sia raggi HeNe che IR, sono necessari due set separati di vetreri…

Representative Results

Il test iniziale dell’allineamento e della resistenza della trappola viene eseguito con perle di polistirene non fluorescente da 1 μm. Poiché la maggior parte della ricerca condotta in laboratorio utilizza la fluorescenza, testiamo ulteriormente la resistenza della trappola utilizzando perline di polistirene verde drago da 1 μm (Figura 1D, E). Successivamente il lavoro cambia l’intrappolamento ottico dei complessi DNA-perline in cui il DNA viene colorato con il colorante …

Discussion

L’assemblaggio accurato del sistema di flusso è fondamentale per il buon esito degli esperimenti 4,6. Uno degli aspetti più impegnativi del protocollo è il fissaggio dei connettori alla superficie del vetro. Per questo, utilizziamo i seguenti due approcci: connettori per tubi press-fit e assemblaggi nanoport. I connettori press-fit aderiscono facilmente al vetro seguiti dalla spinta dei tubi in PTFE nei fori preformati utilizzando una pinza. Quando è richiest…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

La ricerca nel laboratorio Bianco è supportata dalle sovvenzioni NIH GM100156 e GM144414 a P.R.B.

Materials

100x objective Leica 506318 or 506038 Oil immersion lenses; Imaging and optical trapping only; Plan APO objectives optimized for fluorescence imaging
10X Objective Leica 506263 Used to locate laser beams spots during alignment; to find focus and X-Y position in flow cell
1 mm fluorescent beads Bangs Labs FSDG004 Used for tap performance, focal position determination
1 mm polystyrene beads Bangs Labs CPO1004 Used for trap performance evaluation and binding to biotinylated molecules
63x objective Leica 506081 Used to locate laser beams spots during alignment and to find focus and X-y position in flow cell; can be used for optical trapping as it has an identical back aperture diameter to the 100X; oil immersion lens
Alignment laser Lumentum 1100 series 10mW HeNe laser that is visible to the naked eye that is used to position optics
Beam alignment camera Amscope MU303 A simple, inexpensive and software controlled camera for imaging of the beam position
Camera control and Image capture software Hamamatsu HCImage Coordinates activities of the Lambda DG4 with the camera to facilitate rapid wavelength switching
Camera; Orca flash 4 Hamamatsu c13440-20cu CCD camera for imaging of single-molecule experiments
C-mount for the beam alignment camera Spot imaging solutions DE50CMT Provides optimal positioning of the camera for imaging of laser beams during alignment
C-mount for the Orca Flash 4 camera Has a retainer ring to hold an IR blocking filter in place. This eliminates reflected IR beam from the optical traps and facilitates clearer imaging of trapped objects.
Cy5  fluorescence filter cube Semrock cy5-404a-lsc-zero Used in conjunction with Lambda DG4 to image Cy5 only
Fitc-Txred  fluorescence filter cube Semrock fitc/txred-2x-b-000 Used in conjunction with Lambda DG4 to image FITC and TXRed
Fluidics tubing Grace Bio 46004 PTFE tubing as an alternate to PEEK; works well on some flow cells. Can be used with PDMS flow cells or glass flow cells when Grace Bio fit tubing connectors are used
GFP fluorescence filter cube Semrock gfp-3035b-lsc-zero Used in conjunction with Lambda DG4 to image GFP only
Glass flow cells Translume Custom Clear flow channels for imaging (Fig. 2E)
Glass glue Loctite 233841 Securely and easily bonds Nanoport assemblies to glass flow cells
Glass/PDMS sandwich flow cells CIDRA Precision services Custom design Flow cells built according to your specifications; imaging channels are clear (Fig. 2C)
Hamilton Cleaning solution Hamilton 18311 Gentle but efficient cleaning solution for glass flow cells; does not bubble when used carefully
Illumination system Sutter Instrument Lamda DG4 Discontinued so recommend Lambda 721
Illumination system Sutter Instrument Lamda DG4 Discontinued so recommend Lambda 721
Image analysis software Media cybernetics Image Pro Premiere Analysis of images and single molecule tracking
Image analysis software Fiji/NIH Image/Image J Shareware Analysis of images and single molecule tracking
Image display card Melles Griot 06 DLA 001 Alternate product from Thorlabs: VRC5
Immersion oil Zeiss 444960 Immersol 518 F fluorescence free
Laser beam alignment tools Thor labs FMP05/M; dgo5-1500-h1; BHM1  Used to ensure beams are horizontal and at the correct height
Laser beam viewer Canadian Photonics labs IR 3150 Used to image IR beam spots on mirrors and  targets
Laser power meter Thor labs Measurement of laser output as well as trap strength
Laser safety glasses (HeNe) Thor labs LG7 or 8 Blocks >3 OD units of light of wavelengths >600 nm
Laser safety glasses (IR) Thor labs LG11 Blocks >7 OD units of light of wavelengths ³1000 nm
Mcherry  fluorescence filter cube Semrock mcherry-a-lsc-zero Used in conjunction with Lambda DG4 to image mcherry only
Microscope Leica DMIRE2 DIC port removed to accommodate Dichroic trapping/alignment mirror
Microscope control software  UCSF/shareware uManager Controls the microscope, permits focal alignment of objectives as well as stage control
Nanoport assembly IDEX N333 Connectors that are bonded to flow cells
Optical table support Thor Labs PA52502 Active isolation table support
Optics and lenses Solar TII Various Interference mirrors, telescopes and lenses custom designed for the system
PDMS flow cells ufluidix Custom Flow cells built according to your specifications; imaging channels are clear (Figs. 2B and D)
PEEK tubing IDEX 1532 Provides excellent connection to flow cells and switching valves
Pinkel fluorescence filter cube Semrock lf488/543/635-3x-a-000 Used in conjunction with Lambda DG4 to image multiple fluorophores rapidly
Press fit tubing connectors GraceBio 46003 Clear silicone connector with adhesive that binds well to glass
Scanning mirrors GSI Lumonics VM500 Used to provide control of the second optical trap. GSI Lumonics no longer exists. Similar mirrors can be purchased from Cambridge Scientific
Stage Leica
Stage micrometer Electron Microscopy Sciences 68042-08 Provides on screen ruler for positioning of the beam and system calibration
Switching valves IDEX V-101T Control direction of fluid flow and eliminate introduction of bubbles into flow cells
Syringe and valve manifold Machine shop None Custom built
Syringe pump Harvard Apparatus PHD 2000 Controls fluid flow through flow cells
Syringe pump software Harvard Apparatus 70-6000 Flow control provides seamless, programmable control of fluid flow
Syringes Hamilton 81320 Gas-tight, PTFE Luer Lock, glass barrels with Teflon-coated plungers
Table top Thor Labs T36H Optical table top or breadboard
Trapping laser Newport/Spectra Physics J-series; BL106C Nd:YAG laser; 1064 nm; 5W laser

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