Mevcut protokol, Alzheimer hastalığının APP / PS1 transgenik fare modelinde amiloid-beta yükünü ölçmek için sagital fare beyin bölümlerinin tam bölge veya alt bölge analizini gerçekleştirme prosedürünü açıklar ve karşılaştırır.
Amiloid-beta (Aβ) plaklarının hücre dışı birikimi, Alzheimer hastalığının (AD) başlıca patolojik özelliklerinden biridir ve AD için FDA onaylı tek hastalık modifiye edici tedavinin hedefidir. Buna göre, amiloid öncü proteinini aşırı eksprese eden ve böylece serebral Aβ plaklarını biriktiren transgenik fare modellerinin kullanılması, farelerde insan AD’sini modellemek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu nedenle, enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) ve immünoboyama dahil olmak üzere immünoassaylar, AD transgenik farelerden türetilen beyin dokularındaki Aβ yükünü yaygın olarak ölçer. Aβ tespiti ve nicelleştirme yöntemleri iyi kurulmuş ve belgelenmiş olmasına rağmen, beyin dokusunda seçilen ilgi bölgesinin büyüklüğünün immün boyama sonrası Aβ yük ölçümleri üzerindeki etkisi bildirilmemiştir. Bu nedenle, mevcut protokol, bir görüntü analiz yazılımı kullanarak ilgilenilen tam ve alt bölgelerdeki Aβ yük ölçümlerini karşılaştırmayı amaçlamıştır. Beyin dokusu hazırlama, serbest yüzen beyin bölümü immünoboyama, görüntüleme ve Aβ yükünün tam ve alt ilgi alanlarına karşı nicelleştirilmesinde yer alan adımlar, 13 aylık APP / PS1 çift transgenik erkek farelerden türetilen beyin bölümleri kullanılarak açıklanmaktadır. Mevcut protokol ve sonuçlar, ilgi alanının büyüklüğünün Aβ-pozitif alan nicelemesi üzerindeki etkisi hakkında değerli bilgiler sağlar ve yaygın Aβ birikimi gösteren 13 aylık erkek APP / PS1 farelerinden türetilen beyin bölümleri için ilgi analizlerinin tam ve alt bölgeleri kullanılarak elde edilen Aβ-pozitif alan arasında güçlü bir korelasyon olduğunu göstermektedir.
Amerika Birleşik Devletleri’nde altıncı önde gelen ölüm nedeni olan Alzheimer hastalığı (AD), AD ile yaşayan tahmini 6,2 milyon Amerikalı ile halk sağlığı tehdidi olmaya devam etmektedir. Bunun 2060 yılına kadar 13,8 milyona ulaşması bekleniyor1. Bugüne kadar, kolinesteraz inhibitörleri ve memantin gibi ilaçlarla semptomatik yönetim tedavinin birincil seyridir2. AH, amiloid-beta (Aβ) plakların hücre dışı birikimi ve nörofibriler yumaklar şeklinde hücre içi hiperfosforile tau birikimi gibi nöropatolojik bulgularla karakterizedir 3,4. Amiloid öncü proteininin (APP) beta ve gama sekretaz yoluyla endoproteolitik bölünmesiyle oluşan Aβ, oligomerler ve fibriller oluşturmak için toplanır ve nörotoksik etkilere yol açar5. Aβ’nın 1980’lerden beri birincil patolojik bir role hizmet ettiği varsayılmıştır ve AD6 için FDA onaylı tek hastalık modifiye edici tedavinin terapötik hedefidir. Sonuç olarak, genlerdeki mutasyonları barındıran ve sağlam serebral Aβ birikimi ile sonuçlanan transgenik AD fare modelleri, 1990’ların başından beri klinik öncesi AD araştırmaları için yaygın olarak kullanılmaktadır7.
Bu AD transgenik fare beyinlerinde Aβ türlerinin tespiti genellikle iki immünoassay kullanılarak yapılır: enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) ve immünoboyama. Eski tahlil, farklı Aβ türlerinin kantitatif olarak belirlenmesini sağlar ve doku kesitleme, immün boyama, görüntüleme ve nicelleştirme8 dahil olmak üzere birkaç sıralı doku işleme ve görüntüleme adımı gerektiren immünoboyamaya kıyasla daha az zaman alıcıdır. Ayrıca, immün boyama sonrası elde edilen sonuçlar yarı kantitatif8’dir. Bununla birlikte, Aβ’yı mekansal olarak lokalize etme yeteneği, immün boyamayı beyin dokularında Aβ tespiti için çekici bir yaklaşım haline getirir8.
Aβ immün boyama kullanılırken, farklı araştırma grupları tarafından birkaç farklı niceleme paradigması kullanılmıştır. Örneğin, bazı araştırma grupları tüm ilgi bölgesindeki (korteks veya hipokampus) Aβ yükünü ölçerken, diğerleri Aβ yükünü belirli bir ilgi alanı alt bölgesinde (korteksin veya hipokampusun bir kısmı) ölçer9,10,11. Aβ tespiti ve nicelleştirme yöntemleri iyi kurulmuş ve belgelenmiştir, ancak ilgili bölgenin büyüklüğünün immün boyama sonrası Aβ yük ölçümleri üzerindeki etkisi bildirilmemiştir. Bu nedenle, mevcut protokol, bir görüntü analiz yazılımı olan ImageJ’yi kullanarak Aβ yük ölçümlerini ilgilenilen tam ve alt bölgeler arasında karşılaştırmayı amaçladı.
Mevcut çalışma, AD12’nin erken başlangıcını modellemek için kimerik fare / insan APP ve mutant bir presenilin 1’i ifade eden 13 aylık APP / PS1 çift transgenik erkek fareleri kullandı. Aβ birikintileri 6-7 aylıkken gelişmeye başlar ve bu farelerin korteksinde ve hipokampüsünde12 aylıkken 9-10 aylıkken bol miktarda Aβ birikimi gözlenir. Transgenik amiloid peptitler ve holoprotein, 6E10-immün boyama13 ile tespit edilebilir ve bu da onu mevcut protokol için arzu edilen bir hayvan modeli haline getirir. Burada ele alınan prosedür, beyin dokusunun hazırlanmasını, serbest yüzen bölümlerin immün boyamasını, görüntülemeyi ve Aβ yükünün ilgilenilen alt bölgelere karşı tam olarak ölçülmesini içerir. Analiz, tam ve alt bölgesel niceleme arasında güçlü bir korelasyon olduğunu göstererek, bol miktarda Aβ birikintisi gösteren 13 aylık APP / PS1 erkek farelerden türetilen beyin dokusu bölümlerinde bu iki yöntem arasında sağlam bir anlaşma olduğunu göstermektedir.
Burada açıklanan protokol, sagital kesitleme için hemi-beyin hazırlığı, serbest yüzen bölümlerde 6E10 antikoru kullanılarak Aβ birikintilerinin immünofloresan boyanması, Aβ lekeli beyin bölümlerinin görüntülenmesi ve ardından korteksteki Aβ birikintilerinin ve fare beyin dokusunun hipokampusunun bir görüntü analiz yazılımı kullanılarak nicelleştirilmesi prosedürünü özetlemektedir. Beyin dokusu bölüm 8,10’da Aβ yükünü ölçmek için yayınlanmış protokoller olsa da, bu protokol, istenilebileceği zaman, korteks ve hipokampustaki ilgi çekici bir alt bölgedeki Aβ yüküne kıyasla, tüm izo-kortekste (korteks olarak adlandırılır) ve hipokampusta Aβ yükünün ölçülmesinde yer alan adımları açıklar. İlgi analizlerinin tam ve alt bölgeleri arasındaki korelasyon da sağlanmaktadır.
Protokolde birkaç kritik adım vardır. İlk olarak, tarif edilen protokol, serbest yüzen immün boyamaya maruz kalan 20 μm kalınlığındaki beyin dokusu bölümleri içindir ve bu da doku bölümü18’de optimal antikor penetrasyonu ile sonuçlanır. Serbest yüzen teknik, immünofloresan boyama sırasında doku kesitlerinin farklı çözeltiler arasında manuel olarak aktarılmasını ve prosedür boyunca doku kesitlerinin dikkatli bir şekilde kullanılmasını gerektirebilir. Bu, özellikle doku kesitleri mevcut protokolde antijen alımı için% 70 formik asit çözeltisine daldırıldığında çok önemlidir ve ince kesitler için doku kırılganlığını arttırır. Tanımlanan protokole alternatif yaklaşımlar, daha kalın doku kesitlerinin (örneğin, 30-40 μm) kullanılmasını veya immünofloresan boyamadan önce pozitif yüklü slaytlara doğrudan monte edilen doku kesitlerinin kullanılmasını içerir. İkincisi, burada açıklanan protokol floresan etiketli bir 6E10 antikoru kullanır. Floresan etiketli 6E10 antikorunun kullanılmasının yanı sıra, floresan olmayan 6E10 antikorları (örneğin, yaban turpu peroksidaz konjuge 6E10 antikoru) beyin dokusu bölümlerinde Aβ yükünü tespit etmek için de kullanılabilir ve mevcut protokol, daha önce açıklandığı gibi beyin dokusu bölümlerindeki Aβ-pozitif immünokimyasal lekeleri ölçmek için uyarlanabilir8 . Üçüncüsü, Aβ yük ölçümü için sonuçların doğruluğu, doku arka planına ve sinyal yoğunluğuna bağlı olan analiz yazılımındaki uygun eşik seçimine bağlı olacaktır. Eşik seçimi son kullanıcı tarafından yapılmalıdır, böylece niceleme için sadece Aβ-pozitif lekeler seçilir. Eşik ayarının doğruluğunu sağlamak amacıyla tüm görüntülere uygulanabilecek belirli eşiği optimize etmek için son kullanıcı müdahalesi gerekir. Dördüncüsü, ilgi alanı alt bölgesi analizi, doku bölümünde küçük bir ilgi alanı seçmeyi gerektirdiğinden, bu analiz için iki bağımsız okuyucu kullanılmıştır. Veri toplama sırasında bağımsızlığı ve körlüğü korumak için, tüm görüntüler sayı kodludur; görüntü analizi dizisi okuyucular arasında rastgele hale getirildi, böylece farklı okuyucular herhangi bir zamanda farklı görüntüleri analiz etti ve veriler her haftanın sonunda gönderildi. İlgi alanı analizinin alt bölgesinde ilgi alanı seçiminde okuyucular arası değişkenlik olasılığının artması nedeniyle, okuyucular, veri toplamaya başlamadan önce korteks ve hipokampustaki bölge seçimini optimize etmek için birkaç örnek görüntü kullanılarak eğitilmiştir. Bu eğitim, okuyucular arası değişkenliği azaltmak için çok önemlidir ve görülebileceği gibi (Şekil 5A, B), her iki okuyucu tarafından bildirilen 6E10-pozitif alan, mevcut çalışmada güçlü bir göreceli anlaşma göstermektedir.
Mevcut protokol ve sonuçlar, ilgi alanı büyüklüğünün Aβ-pozitif alan nicelemesi üzerindeki etkisi hakkında değerli bilgiler sağlamaktadır. Daha büyük bir ilgi alanının, dokuyu daha küçük bir ilgi alanından daha fazla temsil etmesi beklenir. Bu nedenle, dokulardaki Aβ yükünü doğru bir şekilde ölçmek için daha büyük bir dokudan numune alınması arzu edilir. Bununla birlikte, doku içinde homojen Aβ yük dağılımı durumunda, daha küçük bir örnekleme bölgesi genellikle analiz edilen daha büyük dokunun iyi bir temsili olarak kabul edilir. Mevcut çalışma sonuçları bunu doğrulamaktadır ve tüm korteks ve hipokampustaki Aβ yükü, korteks ve hipokampusun seçilmiş bir alt bölgesindeki Aβ yükünün güçlü bir korelasyonuydu (Şekil 5C, D). İlgi analizlerinin tam ve alt bölgeleri arasındaki anlaşmayı daha da doğrulamak için, korteks ve hipokampustaki ortalama 6E10-pozitif alan karşılaştırıldı ve iki yöntem arasında bir fark bulunamadı (Şekil 5E). Bu, bu yöntemlerden herhangi birinin (tam veya alt bölge analizi) karşılaştırılabilir Aβ yük ölçümleri sağladığını doğrulamaktadır.
Mevcut protokolün bazı sınırlamaları vardır. İki yöntem (tam bölgeye karşı alt bölge analizi) her zaman birbirinin yerine kullanılamayabilir. Tam veya alt bölge analizini kullanma seçimi, AD fare modelinin yaşı, cinsiyeti ve suşundan etkilenen doku içindeki Aβ’nın bölgesel dağılımına bağlı olacaktır. 13 ayda, Aβ yükü APP / PS1 farelerinin korteksi ve hipokampüsü boyunca dağıtılır. Bununla birlikte, 6 ayda, Aβ birikintileri korteksle sınırlıdır ve hipokampus12’de minimum birikintiler gözlenir. Bu koşullar altında, tam ilgi alanı analizi, doku örnekleme alanını ve dolayısıyla Aβ sinyalini artırmak için istenen yaklaşım olabilir. Öte yandan, alt bölge analizi, belirli bir beyin bölgesindeki Aβ yükü ilgi çekici olduğunda (örneğin, somatosensoriyel korteks) tercih edilen yöntem olabilir. Ek olarak, 13 ayda, APP / PS1 erkek fareleri yoğun 6E10-pozitif lekeler gösterir ve immünofloresan boyama çok düşük bir arka plana sahip mükemmel bir sinyalle sonuçlanır ve mevcut protokolü verilen koşullar altında nicelleştirme için çok uygun hale getirir. Bu niceleme yönteminin daha az yoğun boyamaya başarılı bir şekilde uygulanıp uygulanamayacağı belirsizdir ve bu soruyu cevaplamak için gelecekteki çalışmalar gerekecektir. Burada sunulan immünofloresan ve görüntü nicelleştirme yöntemi, öncü form13 de dahil olmak üzere tüm Aβ formlarını tespit eder. Sonuç olarak, belirli bir Aβ türünün (örneğin, Aβ1-40 veya Aβ1-42) tespitinde bir ilgi varsa, bu Aβ izoformlarına özgü antikorlar kullanılabilir. Bu nedenle, 6E10 immünofloresan boyama ve tespit yöntemi, ELISA kullanılarak tüm beyin homojenatlarında Aβ1-42 ölçümlerinin ölçümleri ile ilişkili olmasına rağmen (Şekil 5F, G), korelasyon sadece mütevazıydı. Bu, ELISA kullanılarak sadece Aβ1-42’nin ölçülmesine ve 6E10 immün boyama kullanılarak tüm Aβ türlerinin tespitine bağlanabilir. Mevcut çalışma, tam ve alt bölgesel analizler arasındaki anlaşmayı ve korelasyonu değerlendirmek için üç okuyucu kullanmaktadır. Ek okuyuculara sahip olmak, çalışmanın sağlamlığını artırabilir ve burada sunulan iki yöntem arasındaki anlaşmaları daha da doğrulayabilir. Ayrıca, Pearson korelasyonunu, sürekli değişkenler19 arasındaki anlaşmayı tanımlamak için diğer yöntemlerin yanı sıra yaygın olarak kullanılan bir anlaşma ölçüsü olarak kullanıyoruz. Bununla birlikte, anlaşmayı belirlemek için Pearson korelasyonunu kullanmanın bir sınırlaması, burada kullanılan iki yöntemin ilgili sonuçları sağlayabilmesidir, ancak bir yöntem, sistematik önyargı nedeniyle diğerinden genel olarak daha yüksek değerlerle sonuçlanabilir. Bu nedenle, Pearson korelasyonu göreceli anlaşmanın iyi bir ölçüsüdür19. Protokolün sağlamlığını arttırmak için, ortalama 6E10-pozitif alanın iki yöntemle karşılaştırılması gibi mutlak anlaşmayı doğrulamak için ek yöntemler kullanılabilir (Şekil 5E),19. Birlikte ele alındığında, mevcut protokol, immünofloresan boyama ile tespit edilen Aβ yükünü karşılaştırır ve beyin dokusu bölümlerinde ilgilenilen tam ve alt bölgeleri analiz eder. Sonuçlar, bol miktarda Aβ birikintisi gösteren 13 aylık APP / PS1 erkek farelerden türetilen beyin dokusu bölümleri için bu iki yöntem arasında güçlü bir korelasyon olduğunu göstermektedir.
The authors have nothing to disclose.
Bu yayında bildirilen araştırmalar, Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Yaşlanma Enstitüsü tarafından R01AG062840 (RKS’ye) ve R01AG072896 (RKS’ye) ödül numaraları altında desteklenmiştir. İçerik yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri’nin resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir. Federal fonların yaklaşık 200 bin doları (% 100) bu projeyi destekledi. Ayrıca Dr. Joshua Yang’a el yazması düzenleme konusundaki yardımları için teşekkür ederiz.
15 mL conical tubes | ThermoFisher Scientific, MA, USA | 339650 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650 |
24-well plates | Fisher Scientific, NH, USA | FB012929 | https://www.fishersci.com/shop/products/jet-biofil-surface-treated-steriletissue-culture-plates-3/FB012929 |
Amyloid beta 42 human ELISA kit | ThermoFisher Scientific, MA, USA | KHB3441 | https://www.thermofisher.com/elisa/product/Amyloid-beta-42-Human-ELISA-Kit/KHB3441 |
Aqueous mounting media | Vector laboratories, CA, USA | H-5501-60 | https://vectorlabs.com/products/mounting/vectamount-aq-aqueous-mounting-medium |
Bovine serum albumin | Sigmaaldrich, MO, USA | A2153-50G | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/a2153?gclid=CjwKCAjw9aiIBhA1EiwAJ_G TSiZ9B3YGz3RvSpWqCH4CPW78 Dj4WlgxmzPs631z5IHmy5XLV TdC_jBoC9zQQAvD_BwE |
BZ-X710 Keyence all-in-one fluorescence microscope | Keyence, IL, USA | BZ-X710 | https://www.keyence.com/products/microscope/fluorescence-microscope/bz-x700/models/bz-x710/ |
Clear nail poilsh | User preference | NA | None |
Cryostat | Leica Biosystems, IL, USA | Leica CM1860 Cryostat | https://www.leicabiosystems.com/us/histology-equipment/cryostats/leica-cm1860/ |
Formic acid | Sigmaaldrich, MO, USA | F0507-500ML | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigald/f0507?gclid=CjwKCAjw9aiIBhA1EiwAJ_G TSheH6JMGnla50C3Ag0cLzXE8 BObxvDApl0udjYAPZmBGe7a 8PRUv1RoCt34QAvD_BwE |
Glass coverslips | VWR, PA, USA | 48393-081 | https://us.vwr.com/store/product/4645817/vwr-micro-cover-glasses-rectangular |
GraphPad Prism | GraphPad Software, CA, USA | Version 8 | https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ |
ImageJ 1.51k | National Institutes of Health, MD, USA | Version 1.53e | https://imagej.nih.gov/ij/download.html |
Mice | Jackson Laboratories, ME, USA | 034829-JAX | https://www.mmrrc.org/catalog/sds.php?mmrrc_id=34829 |
Paraformaldehyde | Sigmaaldrich, MO, USA | P6148-500G | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sial/p6148?gclid=CjwKCAjw9aiIBhA1EiwAJ_G TShtLb9Ax9MmRyrFn6Rfmmg 1l52_5XZFXOeXT24ik8Lkw GH7fvlDoHBoChzYQAvD_BwE |
Phenytoin/pentobarbital based anesthetic (Euthasol) | Patterson Veterinary, MA, USA | 07-805-9296 | https://www.pattersonvet.com/Supplies/ProductFamilyDetails/PIF_32818 |
Phosphate-buffered saline | Fisher Scientific, NH, USA | BP661-50 | https://www.fishersci.com/shop/products/pbs-1x-powder-concentrate-white-granular-powder-fisher-bioreagents-2/BP66150 |
Plus (+) microscope slides | Ted Pella, Inc., CA, USA | 260100 | https://www.tedpella.com/histo_html/slides.htm#260384 |
Primary antibody (6E10) | Biolegend, CA, USA | 803013 | https://www.biolegend.com/en-us/products/alexa-fluor-488-anti-beta-amyloid-1-16-antibody-10833 |
Sucrose | Sigmaaldrich, MO, USA | 47289 | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/supelco/47289?gclid=CjwKCAjw9aiIBhA1EiwAJ_ GTSuwlymWL_PUl2KIMHymi GLOWluZdPjf3pRcjMEjQD siItfWiG-C2-RoCxyoQAvD_BwE |
Triton X 100 | Sigmaaldrich, MO, USA | T8787-100ML | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/t8787?context=product |