本方案描述并比较了对矢状小鼠脑切片进行全区域或子区域感兴趣分析的程序,以量化阿尔茨海默病的APP / PS1转基因小鼠模型中的淀粉样蛋白-β负荷。
细胞外淀粉样蛋白β(Aβ)斑块的积累是阿尔茨海默病(AD)的主要病理标志之一,也是FDA批准的唯一AD疾病修饰治疗的目标。因此,免疫测定,包括酶联免疫吸附测定(ELISA)和免疫染色,通常测量来自AD转基因小鼠的脑组织中的Aβ负荷。虽然Aβ检测和定量的方法已经建立并记录在案,但在免疫染色后,脑组织中选择的感兴趣区域的大小对Aβ负荷测量的影响尚未报道。因此,目前的协议旨在使用图像分析软件比较感兴趣的全区域和子区域的Aβ负载测量值。使用来自13个月大的APP / PS1双转基因雄小鼠的脑切片来描述脑组织制备,自由浮动脑切片免疫染色,成像和全非感兴趣亚区域Aβ负荷定量所涉及的步骤。目前的方案和结果提供了有关感兴趣区域大小对Aβ阳性区域定量的影响的宝贵信息,并显示使用来自13个月大的雄性APP / PS1小鼠的大脑切片的全区域和子区域感兴趣的区域获得的Aβ阳性区域之间存在很强的相关性,这些区域显示出广泛的Aβ沉积。
阿尔茨海默病(AD)是美国第六大死因,仍然是一种公共卫生威胁,估计有620万美国人患有AD。预计到2060年将达到1380万1。迄今为止,通过胆碱酯酶抑制剂和美金刚等药物进行对症治疗是治疗的主要疗程2。AD的特征在于神经病理学表现,例如细胞外β-淀粉样蛋白(Aβ)斑块的沉积和细胞内高磷酸化tau以神经原纤维缠结的形式积累3,4。由淀粉样蛋白前体蛋白(APP) 通过 β和γ-分泌酶的内旋溶解裂解形成,Aβ聚集形成低聚物和原纤维,导致神经毒性作用5。自 20 世纪 80 年代以来,Aβ 已被假设为具有主要病理作用,并且是 FDA 批准的唯一 AD6 疾病改善疗法的治疗靶点。因此,自20世纪90年代初以来,转基因AD小鼠模型在基因中携带突变,导致强大的大脑Aβ积累,已被广泛用于临床前AD研究7。
这些AD转基因小鼠大脑中Aβ物种的检测通常使用两种免疫测定法进行:酶联免疫吸附测定(ELISA)和免疫染色。前一种测定能够定量测定不同的Aβ物种,并且与免疫染色相比,它更省时,免疫染色需要几个顺序组织处理和成像步骤,包括组织切片,免疫染色,成像和定量8。此外,免疫染色后获得的结果是半定量的8。然而,空间定位Aβ的能力使得免疫染色成为脑组织中Aβ检测的一种有吸引力的方法8。
在使用Aβ免疫染色时,不同的研究小组已经采用了几种不同的定量范式。例如,一些研究小组量化整个感兴趣区域(皮层或海马体)中的Aβ负荷,而另一些研究小组则量化指定感兴趣子区域(皮层或海马体的一部分)中的Aβ负荷9,10,11。虽然Aβ检测和定量的方法已经建立并记录在案,但尚未报道免疫染色后感兴趣区域的大小对Aβ负载测量的影响。因此,目前的协议旨在使用图像分析软件ImageJ比较感兴趣的全区域和子区域的Aβ负载测量值。
目前的研究使用13个月大的APP / PS1双转基因雄性小鼠,其表达嵌合小鼠/人类APP和突变前enilin 1,以模拟AD12的早期发作。Aβ沉积物在6-7月龄时开始发育,并且在12岁9-10个月大时在这些小鼠的皮层和海马体中观察到丰富的Aβ积累。转基因淀粉样肽和全蛋白可以通过6E10-免疫染色13检测,使其成为本方案的理想动物模型。本文涵盖的程序包括脑组织制备,自由浮动切片的免疫染色,成像以及全孔与子区域中Aβ负荷的定量。该分析显示全区域和次区域定量之间存在很强的相关性,表明这两种方法在来自13个月大的APP / PS1雄性小鼠的脑组织切片中具有很强的一致性,这些雄性小鼠显示出丰富的Aβ沉积物。
这里描述的方案概述了半脑制备矢状截面的程序,在自由浮动切片上使用6E10抗体对Aβ沉积物进行免疫荧光染色,对Aβ染色的脑切片进行成像,然后使用图像分析软件对小鼠脑组织的皮层和海马体中的Aβ沉积物进行定量。虽然有已发表的方案可以量化脑组织切片8,10中的Aβ负荷,但该方案描述了在整个等皮层(称为皮层)和海马体中与皮层和海马体中感兴趣的子区域中的Aβ负荷进行定量所涉及的步骤,当可能需要这样做时。还提供了感兴趣分析的全区域与子区域之间的相关性。
该协议中有几个关键步骤。首先,所描述的方案是用于对20μm厚的脑组织切片进行自由浮动的免疫染色,这导致抗体在组织切片18内的最佳渗透。自由浮动技术可能需要在免疫荧光染色期间在不同溶液之间手动转移组织切片,并在整个过程中仔细处理组织切片。在当前方案中,当组织切片浸入70%甲酸溶液中以进行抗原检索时,这一点尤其重要,这增加了薄切片的组织脆性。所述方案的替代方法包括使用较厚的组织切片(例如,30-40μm)或使用在免疫荧光染色之前直接安装在带正电荷的载玻片上的组织切片。其次,本文描述的方案使用荧光标记的6E10抗体。除了使用荧光标记的6E10抗体外,非荧光6E10抗体(例如,辣根过氧化物酶偶联6E10抗体)也可用于检测脑组织切片中的Aβ负荷,并且当前的方案可以适应量化脑组织切片中的Aβ阳性免疫化学染色,如前所述8.第三,Aβ负荷定量结果的准确性将取决于分析软件中适当的阈值选择,这取决于组织背景和信号强度。阈值选择必须由最终用户执行,以便仅选择Aβ阳性染色进行定量。需要最终用户干预来优化可应用于所有图像的特定阈值,以确保阈值设置的准确性。第四,由于感兴趣的子区域分析需要在组织部分中选择一个小的感兴趣区域,因此使用两个独立的阅读器进行此分析。为了在数据收集过程中保持独立性和盲法,所有图像都进行了编号编码;图像分析序列在读者之间随机化,以便不同的读者在任何给定时间分析不同的图像,并在每周结束时提交数据。由于在感兴趣的子区域分析中,在感兴趣的区域选择中,读取器间变异的可能性增加,因此在开始数据收集之前,使用几个样本图像对读取器进行了训练,以优化皮层和海马体中的区域选择。这种训练对于减少读者之间的变异性至关重要,可以看出(图5A,B),两位读者报告的6E10阳性区域在当前研究中显示出很强的相对一致性。
目前的实验方案和结果提供了关于感兴趣区域大小对Aβ正区域定量的影响的宝贵信息。较大的感兴趣区域应比较小的感兴趣区域更能代表组织。因此,需要对较大的组织进行采样以准确量化组织中的Aβ负荷。然而,在组织内Aβ负荷分布均匀的情况下,较小的采样区域通常被认为是所分析的较大组织的良好代表。目前的研究结果证实了这一点,整个皮层和海马体中的Aβ负荷与皮层和海马体的选定亚区域中的Aβ负荷密切相关(图5C,D)。为了进一步确认感兴趣的全区域和子区域之间的一致性,比较了皮层和海马体中的平均6E10阳性区域,并且发现两种方法之间没有差异(图5E)。这证实了这两种方法中的任何一种(全区域或子区域分析)都能产生可比的Aβ负载测量结果。
当前的协议有一些限制。这两种方法(全区域分析与子区域分析)可能并不总是可以互换使用。使用全区域或亚区域分析的选择将取决于Aβ在组织内的区域分布,这受到AD小鼠模型的年龄,性别和菌株的影响。在13个月时,Aβ负荷分布在APP / PS1小鼠的整个皮质和海马体中。然而,在6个月时,Aβ沉积物仅限于皮层,并且在海马体12中观察到最小的沉积物。在这样的条件下,全感兴趣区域分析可能是增加组织采样面积并因而增加Aβ信号的所需方法。另一方面,亚区域分析可能是当感兴趣的特定大脑区域(例如,躯体感觉皮层)中的Aβ负荷时的首选方法。此外,在13个月时,APP / PS1雄性小鼠表现出强烈的6E10阳性染色,并且免疫荧光染色产生具有非常低背景的出色信号,使得当前的方案非常适合在给定条件下进行定量。目前尚不清楚这种定量方法是否可以成功地应用于强度较低的染色,未来的工作将需要回答这个问题。本文提出的免疫荧光和图像定量方法检测所有形式的Aβ,包括前体形式13。因此,如果对检测特定的Aβ物种(例如,Aβ1-40或Aβ1-42)感兴趣,则可以使用这些Aβ亚型的特异性抗体。因此,尽管6E10免疫荧光染色和检测方法与使用ELISA的全脑匀浆中Aβ1-42测量的测量结果相关(图5F,G),但相关性仅为适度。这可以归因于仅使用ELISA测量Aβ1-42,并使用6E10免疫染色检测所有Aβ物种。本研究使用三位读者来评估全区域分析与次区域分析之间的一致性和相关性。拥有额外的读者可能会提高研究的稳健性,并且可以进一步验证此处介绍的两种方法之间的一致性。此外,我们使用皮尔逊相关作为一致性的度量,这在其他方法中被广泛用于描述连续变量19之间的一致性。然而,使用Pearson相关性来确定一致性的一个限制是,本文使用的两种方法可以提供相关结果,但由于系统偏倚,一种方法可能导致总体值高于另一种方法。因此,皮尔逊相关是相对一致性19的良好衡量标准。为了增加协议的鲁棒性,可以使用其他方法来确认绝对一致性,例如通过两种方法比较平均6E10正区域(图5E),可以使用19。综上所述,目前的方案比较了免疫荧光染色检测到的Aβ负荷,并分析了脑组织切片中感兴趣的全区域和子区域。结果显示,这两种方法与13个月大的APP / PS1雄性小鼠的脑组织切片之间存在很强的相关性,这些小鼠显示出丰富的Aβ沉积物。
The authors have nothing to disclose.
本出版物中报告的研究得到了美国国立卫生研究院国家老龄化研究所的支持,奖励号为R01AG062840(RKS)和R01AG072896(RKS)。内容完全由作者负责,并不一定代表美国国立卫生研究院的官方观点。大约20万美元(100%)的联邦资金支持了这个项目。我们还要感谢杨约书亚博士在稿件编辑方面的协助。
15 mL conical tubes | ThermoFisher Scientific, MA, USA | 339650 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650 |
24-well plates | Fisher Scientific, NH, USA | FB012929 | https://www.fishersci.com/shop/products/jet-biofil-surface-treated-steriletissue-culture-plates-3/FB012929 |
Amyloid beta 42 human ELISA kit | ThermoFisher Scientific, MA, USA | KHB3441 | https://www.thermofisher.com/elisa/product/Amyloid-beta-42-Human-ELISA-Kit/KHB3441 |
Aqueous mounting media | Vector laboratories, CA, USA | H-5501-60 | https://vectorlabs.com/products/mounting/vectamount-aq-aqueous-mounting-medium |
Bovine serum albumin | Sigmaaldrich, MO, USA | A2153-50G | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/a2153?gclid=CjwKCAjw9aiIBhA1EiwAJ_G TSiZ9B3YGz3RvSpWqCH4CPW78 Dj4WlgxmzPs631z5IHmy5XLV TdC_jBoC9zQQAvD_BwE |
BZ-X710 Keyence all-in-one fluorescence microscope | Keyence, IL, USA | BZ-X710 | https://www.keyence.com/products/microscope/fluorescence-microscope/bz-x700/models/bz-x710/ |
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Glass coverslips | VWR, PA, USA | 48393-081 | https://us.vwr.com/store/product/4645817/vwr-micro-cover-glasses-rectangular |
GraphPad Prism | GraphPad Software, CA, USA | Version 8 | https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ |
ImageJ 1.51k | National Institutes of Health, MD, USA | Version 1.53e | https://imagej.nih.gov/ij/download.html |
Mice | Jackson Laboratories, ME, USA | 034829-JAX | https://www.mmrrc.org/catalog/sds.php?mmrrc_id=34829 |
Paraformaldehyde | Sigmaaldrich, MO, USA | P6148-500G | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sial/p6148?gclid=CjwKCAjw9aiIBhA1EiwAJ_G TShtLb9Ax9MmRyrFn6Rfmmg 1l52_5XZFXOeXT24ik8Lkw GH7fvlDoHBoChzYQAvD_BwE |
Phenytoin/pentobarbital based anesthetic (Euthasol) | Patterson Veterinary, MA, USA | 07-805-9296 | https://www.pattersonvet.com/Supplies/ProductFamilyDetails/PIF_32818 |
Phosphate-buffered saline | Fisher Scientific, NH, USA | BP661-50 | https://www.fishersci.com/shop/products/pbs-1x-powder-concentrate-white-granular-powder-fisher-bioreagents-2/BP66150 |
Plus (+) microscope slides | Ted Pella, Inc., CA, USA | 260100 | https://www.tedpella.com/histo_html/slides.htm#260384 |
Primary antibody (6E10) | Biolegend, CA, USA | 803013 | https://www.biolegend.com/en-us/products/alexa-fluor-488-anti-beta-amyloid-1-16-antibody-10833 |
Sucrose | Sigmaaldrich, MO, USA | 47289 | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/supelco/47289?gclid=CjwKCAjw9aiIBhA1EiwAJ_ GTSuwlymWL_PUl2KIMHymi GLOWluZdPjf3pRcjMEjQD siItfWiG-C2-RoCxyoQAvD_BwE |
Triton X 100 | Sigmaaldrich, MO, USA | T8787-100ML | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/t8787?context=product |