Özet

Identifizierung der hämolytischen und Phospholipase-Aktivität in Rohextrakten aus Seeanemonen durch einfache Bioassays

Published: March 29, 2022
doi:

Özet

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Gewinnung von Rohgiftextrakt aus Seeanemone und zum Nachweis seiner hämolytischen und Phospholipase-Aktivität.

Abstract

Die Zusammensetzung des Seeanemonengifts umfasst Polypeptid- und Nichtproteinmoleküle. Zytolytische Komponenten haben ein hohes biotechnologisches und biomedizinisches Potenzial für die Entwicklung neuer molekularer Werkzeuge. Seeanemonengift lokalisiert sich in Drüsenzellen aus Ektoderm und subzellulären Strukturen, die Nematozysten genannt werden, die beide im gesamten Meeresanemonenkörper verteilt sind. Diese Eigenschaft bringt Herausforderungen mit sich, da die Zellen und die Nematozyste lysiert werden müssen, um die Giftkomponenten mit anderen ungiftigen Molekülen freizusetzen. Daher wird das Gift zunächst aus einem Rohextrakt (Mischung aus verschiedenen und vielfältigen Molekülen und Gewebeablagerungen) gewonnen. Der nächste Schritt besteht darin, Polypeptide mit spezifischen Bioaktivitäten nachzuweisen. Hier beschreiben wir eine effiziente Strategie zur Gewinnung des Ozeananemonen-Rohölextrakts und des Bioassays, um das Vorhandensein von Cytolysinen zu identifizieren. Der erste Schritt beinhaltet kostengünstige und unkomplizierte Techniken (Rühr- und Frost-Tau-Zyklus) zur Freisetzung von Cytolysinen. Wir erhielten die höchste zytolytische Aktivität und das höchste Protein (~ 500 mg Protein aus 20 g Trockengewicht). Als nächstes wurde die Polypeptidkomplexität des Extrakts durch SDS-PAGE-Gel analysiert, das Proteine mit Molekulargewichten zwischen 10 kDa und 250 kDa nachweist. Im hämolytischen Assay verwendeten wir rote Blutkörperchen von Schafen und bestimmten HU50 (11,1 ± 0,3 μg/ml). Im Gegensatz dazu wurde das Vorhandensein von Phospholipasen im Rohextrakt unter Verwendung von Eigelb als Substrat in einem festen Medium mit Agarose bestimmt. Insgesamt verwendet diese Studie ein effizientes und kostengünstiges Protokoll zur Herstellung des Rohextrakts und wendet replizierbare Bioassays an, um Cytolysine, Moleküle mit biotechnologischen und biomedizinischen Interessen, zu identifizieren.

Introduction

Meerestiere sind eine reiche Quelle biologisch aktiver Verbindungen. In den letzten Jahrzehnten hat die Zusammensetzung des Seeanemonengifts wissenschaftliche Aufmerksamkeit erregt, da es eine Vielzahl von Polypeptiden mit hämolytischer, zytotoxischer, enzymatischer (Phospholipase, Protease, Chitinase) und neurotoxischer Aktivität und hemmenden Wirkungen auf die proteolytische Aktivitätumfasst 1. Darüber hinaus sind diese Polypeptide potenzielle Quellen für die Entwicklung molekularer Werkzeuge im biotechnologischen und therapeutischen Einsatz 2,3.

Es gibt nur wenige Berichte über Seeanemonengift und seine molekularen Komponenten aufgrund der Komplexität der Gewinnung des Giftes, sogar der Isolierung und Charakterisierung von Toxinen. Die in den Berichten verwendeten Extraktionsmethoden beinhalteten die Lyse und Entleerung des Inhalts von Zellen, die mit der Giftproduktion zusammenhängen und nicht damit zusammenhängen1.

Ein besonderes Merkmal bei allen Nesseltieren ist das Fehlen eines Systems zur Produktion und Freisetzung des Giftes, das in einer einzigen anatomischen Region zentralisiert ist. Stattdessen sind die Nematozysten Strukturen, die das Gift 4,5 halten. Andere Arten von Zellen, sogenannte epidermale Drüsenzellen, sezernieren ebenfalls Toxine und sind auch im ganzen Körper der Seeanemonenverteilt 6.

Die erste und wichtigste Herausforderung bei der Gewinnung des Giftes ist die Erzeugung eines Extrakts mit ausreichender Manipulation in nachfolgenden Prozessen, ohne die Inaktivierung oder den Abbau von labilen Proteinen. Als nächstes müssen die Zellen lysiert werden, und die Komponenten – in diesem Fall Polypeptide – müssen effizient und schnell extrahiert werden, wobei Proteolyse und Hydrolyse vermieden werden, während andere zelluläre Komponenten eliminiertwerden 7.

Verschiedene Methoden werden verwendet, um den Rohextrakt einer Seeanemone zu erhalten; Einige beinhalten das Opfern des Organismus, während andere es erlauben, ihn am Leben zu erhalten. Methoden, die die Verwendung des gesamten Körpers des Organismus implizieren, ermöglichen die Freisetzung der meisten Toxine aus dem Gift8, verglichen mit Methoden, die Organismen am Leben erhalten, die nur einige Bestandteile des Giftesextrahieren 9. Die Herstellung eines Extrakts erfordert die Bewertung des Vorhandenseins und der Wirksamkeit einer Substanz von Interesse durch einen spezifischen Bioassay, der Strategien zur Beobachtung der pharmakologischen Wirkungen durch In-vivo- oder In-vitro-Methoden 10 umfasst.

Seeanemonengift enthält zytolytische Polypeptide, porenbildende Toxine (PFTs)11 und Phospholipasen12; Diese Moleküle sind Modelle bei der Untersuchung der Protein-Lipid-Interaktion, molekulare Werkzeuge in der Krebstherapie und Biosensoren auf der Grundlage von Nanopore3. Die Klassifizierung von Seeanemonen-PFTs erfolgt nach ihrer Größe oder ihrem Molekulargewicht, von 5 kDa bis 80 kDa. Das 20 kDa PFT, das am meisten untersuchte und als Actinoporine11 bekannte PFT, ist von besonderem Interesse wegen seines biomedizinischen Potenzials bei der Entwicklung molekularer Werkzeuge für mögliche Anwendungen wie krebshemmende, antimikrobielle und nanoporenbasierte Biosensoren. Ein anderes Cytolysin, einschließlich Phospholipasen, insbesondere Phospholipase A2 (PLA2)13, setzt eine Fettsäure frei und hydrolysiert Phospholipide, wodurch die Zellmembran destabilisiert wird. Aufgrund dieses Wirkmechanismus verspricht PLA2 ein wesentliches Modell für die Erforschung und Anwendung bei entzündlichen Erkrankungen zu sein. Es könnte als Modell für Untersuchungen des Lipidverhaltens in der Zellmembrandienen 14.

Hier beschreiben wir ein effizientes Protokoll zur Gewinnung des Rohölextrakts aus der Seeanemone Anthopleura dowii Verrill, 1869, und zum Nachweis von Hämolysinen und Phospholipasen. Beide sind relevante Toxine, die als Vorlage für die Entwicklung neuer molekularer Werkzeuge verwendet werden könnten.

Protocol

Die Seeanemonen wurden nach Richtlinien der Nationalen Kommission für Aquakultur, Fischerei und Ernährung der mexikanischen Bundesregierung (Genehmigungsnummer PPF / DGOPTA 07332.250810.4060) gesammelt. Die Bioethikkommission des Instituts für Biotechnologie der Nationalen Autonomen Universität von Mexiko genehmigte alle Experimente mit Seeanemonen. Die Schafblutprobe wurde am Zentrum für praktische Lehre und Forschung in der Tierproduktion und -gesundheit (CEPIPSA, Nationale Autonome Universität von Mexiko) gekauf…

Representative Results

Die repräsentativen Ergebnisse des Protokolls, das zur Gewinnung des Rohölextrakts aus Seeanemone verwendet wurde, zeigten, dass die Kombination von zwei Techniken (Rühren und Zyklen des Einfrierens und Auftauens) zu einer effizienten Entladung von Nematozysten führte und die Gesamtmenge an Protein 500 mg (8 mg / ml) betrug (Abbildung 3). Die Proteinkomplexität des Rohextrakts konnte von 10 kDa und größer als 250 kDa durch SDS-PAGE-Elektrophorese beobachtet…

Discussion

Die hohe Nachfrage nach neuen Verbindungen mit Anwendungen in verschiedenen Bereichen der Wissenschaft und Industrie hat zur Erforschung von Gift geführt. Venom stellt eine reiche Quelle von Molekülen dar, die als Vorlage für die Generierung neuer molekularer Werkzeuge dient. Die Komplexität dieser Gifte erfordert jedoch die Implementierung und Kombination verschiedener Methoden, um sie zu erhalten und zu untersuchen.

Hier zeigen wir eine Methode zur Gewinnung und Analyse des Giftes der <e…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde von Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT) mit der Fördernummer IT200819 unterstützt. Die Autoren danken Tom Musselman, Rock Paper Editing, LLC, für die Überprüfung der englischen Grammatik dieses Manuskripts; und die technische Hilfe von Samanta Jiménez (CICESE, Ensenada) und Juan Manuel Barbosa Castillo (Instituto de Fisiología Celular, UNAM). Wir danken auch Dr. Augusto César Lizarazo Chaparro (CEPIPSA) für die Gewinnung von Schafblut. Wir danken insbesondere Dr. José Saniger Blesa, ICAT-UNAM, für die Einrichtungen in seinem Labor für die Videoaufzeichnung.

Materials

15 mL conical centrifuge tube Corning 430766
2-Bromophenol blue Sigma B75808
2-mercaptoetanol Sigma-Aldrich M6250-100ML
50 mL conical centrifuge tubes Corning 430828
Acetic Acid Glacial J.T. Baker 9515-03
Acrylamide Promega V3115
Agarose Promega V3125
Bisacrylamide Promega V3143
Bovine Serum Albumin Fraction V Sigma A3059-100G
Bradford Protein Assays Bio-Rad 5000006
Calcium chloride Sigma-Aldrich C3306
Cell culture plates 96 well, V-bottom Corning 3894
Centrifuge Eppendorf 5804R
Centrifuge tubes Corning CLS430829
ChemiDoc MP system Bio-Rad 1708280
Citric acid Sigma-Aldrich 251275
Clear flat.bottom 96-Well Plates Thermo Scientific 3855
Coomassie Brilliant Blue G-250 Bio-Rad #1610406
Coomassie brilliant blue R-250 Bio-Rad 1610400
Dextrose J.T. Baker 1916-01
Ductless Enclosure Labconco Vertical https://imagej.nih.gov/ij ImageJ 1.53c
Gel Doc EZ Bio Rad. Gel Documentation System
Glycerol Sigma-Aldrich G5516-4L
Hemocytometer Marienfeld 650030
ImageJ (Software) NIH, USA Version 1.53c
Incubator 211 Labnet I5211 DS
Methanol J.T. Baker 9049-03
Mini-PROTEAN tetra cell Bio-Rad 1658000EDU
Na2HPO4 J.T. Baker 3824-01
NaCl J.T. Baker 3624-01
NaH2PO4.H2O J.T. Baker 3818-05
Origin software version 9 To design the plot with sigmoidal adjustments
Petridish Falcon 351007
Pipetman kit Gilson F167380
Precast mini gel BioRad 1658004
Prestained Protein Ladder Thermo Scientific 26620
Protease Inhibitor Cocktail Roche 11836153001
Protein Assay Dye Reagent Concentrate Bio-Rad 5000006
Rhodamine 6G Sigma-Aldrich 252433
SDS Sigma-Aldrich L4509
Sodium citrate dihydrate JT Baker 3646-01
Spectrophotometer THERMO SCIENTIFIC G10S UV-VIS
Tris Base Sigma-Aldrich 77-86-1
Volt Power Supply Hoefer PS300B

Referanslar

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Bu Makaleden Alıntı Yapın
Ramírez-Carreto, S., Salazar-García, S. I., Macías Martínez, G., Rodríguez-Almazán, C. Identification of Hemolytic and Phospholipase Activity in Crude Extracts from Sea Anemones by Straightforward Bioassays. J. Vis. Exp. (181), e63630, doi:10.3791/63630 (2022).

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