Identifizierung der hämolytischen und Phospholipase-Aktivität in Rohextrakten aus Seeanemonen durch einfache Bioassays

Meerestiere sind eine reiche Quelle biologisch aktiver Verbindungen. In den letzten Jahrzehnten hat die Zusammensetzung des Seeanemonengifts wissenschaftliche Aufmerksamkeit erregt, da es eine Vielzahl von Polypeptiden mit hämolytischer, zytotoxischer, enzymatischer (Phospholipase, Protease, Chitinase) und neurotoxischer Aktivität und hemmenden Wirkungen auf die proteolytische Aktivität^{umfasst 1}. Darüber hinaus sind diese Polypeptide potenzielle Quellen für die Entwicklung molekularer Werkzeuge im biotechnologischen und therapeutischen Einsatz ^2,3.

Es gibt nur wenige Berichte über Seeanemonengift und seine molekularen Komponenten aufgrund der Komplexität der Gewinnung des Giftes, sogar der Isolierung und Charakterisierung von Toxinen. Die in den Berichten verwendeten Extraktionsmethoden beinhalteten die Lyse und Entleerung des Inhalts von Zellen, die mit der Giftproduktion zusammenhängen und nicht damit zusammenhängen¹.

Ein besonderes Merkmal bei allen Nesseltieren ist das Fehlen eines Systems zur Produktion und Freisetzung des Giftes, das in einer einzigen anatomischen Region zentralisiert ist. Stattdessen sind die Nematozysten Strukturen, die das Gift ^4,5 halten. Andere Arten von Zellen, sogenannte epidermale Drüsenzellen, sezernieren ebenfalls Toxine und sind auch im ganzen Körper der Seeanemonen^{verteilt 6}.

Die erste und wichtigste Herausforderung bei der Gewinnung des Giftes ist die Erzeugung eines Extrakts mit ausreichender Manipulation in nachfolgenden Prozessen, ohne die Inaktivierung oder den Abbau von labilen Proteinen. Als nächstes müssen die Zellen lysiert werden, und die Komponenten – in diesem Fall Polypeptide – müssen effizient und schnell extrahiert werden, wobei Proteolyse und Hydrolyse vermieden werden, während andere zelluläre Komponenten eliminiert^{werden 7}.

Verschiedene Methoden werden verwendet, um den Rohextrakt einer Seeanemone zu erhalten; Einige beinhalten das Opfern des Organismus, während andere es erlauben, ihn am Leben zu erhalten. Methoden, die die Verwendung des gesamten Körpers des Organismus implizieren, ermöglichen die Freisetzung der meisten Toxine aus dem Gift⁸, verglichen mit Methoden, die Organismen am Leben erhalten, die nur einige Bestandteile des Giftes^{extrahieren 9}. Die Herstellung eines Extrakts erfordert die Bewertung des Vorhandenseins und der Wirksamkeit einer Substanz von Interesse durch einen spezifischen Bioassay, der Strategien zur Beobachtung der pharmakologischen Wirkungen durch In-vivo- oder In-vitro-Methoden ¹⁰ umfasst.

Seeanemonengift enthält zytolytische Polypeptide, porenbildende Toxine (PFTs)¹¹ und Phospholipasen¹²; Diese Moleküle sind Modelle bei der Untersuchung der Protein-Lipid-Interaktion, molekulare Werkzeuge in der Krebstherapie und Biosensoren auf der Grundlage von Nanopore³. Die Klassifizierung von Seeanemonen-PFTs erfolgt nach ihrer Größe oder ihrem Molekulargewicht, von 5 kDa bis 80 kDa. Das 20 kDa PFT, das am meisten untersuchte und als Actinoporine¹¹ bekannte PFT, ist von besonderem Interesse wegen seines biomedizinischen Potenzials bei der Entwicklung molekularer Werkzeuge für mögliche Anwendungen wie krebshemmende, antimikrobielle und nanoporenbasierte Biosensoren. Ein anderes Cytolysin, einschließlich Phospholipasen, insbesondere Phospholipase A2 (PLA2)¹³, setzt eine Fettsäure frei und hydrolysiert Phospholipide, wodurch die Zellmembran destabilisiert wird. Aufgrund dieses Wirkmechanismus verspricht PLA2 ein wesentliches Modell für die Erforschung und Anwendung bei entzündlichen Erkrankungen zu sein. Es könnte als Modell für Untersuchungen des Lipidverhaltens in der Zellmembran^{dienen 14}.

Hier beschreiben wir ein effizientes Protokoll zur Gewinnung des Rohölextrakts aus der Seeanemone Anthopleura dowii Verrill, 1869, und zum Nachweis von Hämolysinen und Phospholipasen. Beide sind relevante Toxine, die als Vorlage für die Entwicklung neuer molekularer Werkzeuge verwendet werden könnten.