Özet

通过直接生物测定法鉴定海葵粗提取物中的溶血和磷脂酶活性

Published: March 29, 2022
doi:

Özet

在这里,我们描述了一种从海葵中获得粗毒血清提取物并检测其溶血和磷脂酶活性的方案。

Abstract

海葵毒液组合物包括多肽和非蛋白质分子。细胞溶解成分在设计新的分子工具方面具有很高的生物技术和生物医学潜力。海葵毒液位于外胚层和称为线囊的亚细胞结构的腺细胞中,两者都分布在整个海葵体内。这一特征意味着挑战,因为细胞和线虫囊囊必须裂解以释放与其他无毒分子一起释放毒液成分。因此,首先,毒液来源于粗提取物(不同和不同的分子和组织碎片的混合物)。下一步是检测具有特定生物活性的多肽。在这里,我们描述了一种获得海葵粗提取物和生物测定的有效策略,以鉴定细胞溶解素的存在。第一步涉及廉价和直接的技术(搅拌和冻融循环)来释放细胞溶解素。我们获得了最高的细胞溶解活性和蛋白质(从20克干重中获得约500毫克蛋白质)。接下来,通过SDS-PAGE凝胶检测分子量在10 kDa和250 kDa之间的蛋白质来分析提取物的多肽复杂性。在溶血测定中,我们使用绵羊红细胞并测定HU50 (11.1±0.3μg/ mL)。相比之下,使用蛋黄作为底物在琼脂糖固体介质中测定粗提取物中磷脂酶的存在。总体而言,本研究使用高效且廉价的方案来制备粗提取物,并应用可复制的生物测定来鉴定细胞溶解素,具有生物技术和生物医学兴趣的分子。

Introduction

海洋动物是生物活性化合物的丰富来源。近几十年来,海葵毒液的组成引起了科学的关注,因为它由多种多肽组成,具有溶血性,细胞毒性,酶促性(磷脂酶,蛋白酶,几丁质酶)和神经毒性活性和对蛋白水解活性的抑制作用1。此外,这些多肽是开发分子工具在生物技术和治疗用途中的潜在来源23

关于海葵毒液及其分子成分的报道很少,因为获得毒液的复杂性,甚至分离和毒素的表征。报告中使用的提取方法涉及裂解和排空与毒液产生1相关且无关的细胞内容物。

所有蜈蝓病患者的一个特殊特征是缺乏集中在单个解剖区域的毒液生产和释放系统。相反,线虫囊是保持毒液45的结构。其他类型的细胞,称为表皮腺细胞,也分泌毒素,并且也分布在海葵体内6

获得毒液的第一个也是最关键的挑战是在后续过程中产生具有充分操作的提取物,而不会灭活或降解不稳定的蛋白质。接下来,必须裂解细胞,并且组分 – 在这种情况下,必须有效和快速地提取多肽,避免蛋白水解和水解,同时消除其他细胞组分7

使用不同的方法获得海葵的粗提取物;有些涉及牺牲生物体,而另一些则允许它保持活力。暗示使用生物体整个身体的方法允许从毒液8中释放大多数毒素,而保持生物体存活的方法仅提取毒液的某些成分9。提取物的制备需要通过特定的生物测定法评估目标物质的存在和效力,其中包括通过 体内体外 方法观察药理作用的策略10

海葵毒含有细胞溶解多肽,成孔毒素(PFT)11和磷脂酶12;这些分子是研究蛋白质 – 脂质相互作用,癌症治疗中的分子工具以及基于纳米孔3的生物传感器模型。海葵PFT的分类是根据其大小或分子量进行的,从5 kDa到80 kDa。20 kDa PFT是研究最多和被称为放线菌素11的,因其在开发分子工具方面具有特别感兴趣的生物医学潜力,可用于抗癌,抗菌和基于纳米孔的生物传感器。另一种细胞溶解素,包括磷脂酶,特别是磷脂酶A2(PLA2)13,释放脂肪酸并水解磷脂,破坏细胞膜的稳定性。由于这种作用机制,PLA2有望成为炎症性疾病研究和应用的重要模型。它可以作为研究细胞膜14中脂质行为的模型。

在这里,我们描述了一种有效的方案,用于从海葵 Anthopleura dowii Verrill(1869)获得粗提取物,并检测溶血素和磷脂酶。两者都是相关的毒素,可以用作设计新分子工具的模板。

Protocol

海葵是根据墨西哥联邦政府水产养殖、渔业和食品国家委员会的指导方针(许可证号PPF / DGOPTA 07332.250810.4060)收集的。墨西哥国立自治大学生物技术研究所生物伦理学委员会批准了海葵的所有实验。绵羊血液样本是在动物生产和健康实用教学和研究中心(CEPIPSA,墨西哥国立自治大学)购买的。 1. 生物体收集 收集海葵 A. dowii。注:此处,这些生?…

Representative Results

用于获得海葵粗提取物的方案的代表性结果表明,结合两种技术(搅拌和冷冻和解冻循环)产生了线虫囊肿的有效排出,蛋白质总量为500mg(8mg / mL)(图3)。 粗提取物的蛋白质复杂性可以通过SDS-PAGE电泳从10 kDa和大于250 kDa观察到。此外,在15 kDa和20 kDa的分子量区检测到细胞溶解素,其分子量范围可能对应于磷脂酶13 或放线菌素<sup clas…

Discussion

对新化合物的高需求在科学和工业的不同领域都有应用,这导致了对毒液的研究。毒液代表了丰富的分子来源,可作为生成新分子工具的模板。然而,这些毒液的复杂性需要实施和组合各种方法来获取和研究它们。

在这里,我们展示了一种获取和分析海葵 Anthopleura dowii的毒液的方法,Verrill 1869,可用于探索其他海葵物种的毒液,从冻干标本开始,然后粗提取。冻干步?…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

这项工作得到了Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica(PAPIIT)的支持,赠款编号为IT200819。作者感谢Tom Musselman,Rock Paper Editing,LLC,检查了这份手稿的英语语法;以及萨曼塔·希门尼斯(CICESE,恩塞纳达)和胡安·曼努埃尔·巴尔博萨·卡斯蒂略(墨西哥国立自治大学塞卢拉研究所)的技术援助。我们还感谢Augusto César Lizarazo Chaparro博士(CEPIPSA)获得绵羊血液。我们特别感谢ICAT-UNAM的José Saniger Blesa博士,感谢他实验室的录像设施。

Materials

15 mL conical centrifuge tube Corning 430766
2-Bromophenol blue Sigma B75808
2-mercaptoetanol Sigma-Aldrich M6250-100ML
50 mL conical centrifuge tubes Corning 430828
Acetic Acid Glacial J.T. Baker 9515-03
Acrylamide Promega V3115
Agarose Promega V3125
Bisacrylamide Promega V3143
Bovine Serum Albumin Fraction V Sigma A3059-100G
Bradford Protein Assays Bio-Rad 5000006
Calcium chloride Sigma-Aldrich C3306
Cell culture plates 96 well, V-bottom Corning 3894
Centrifuge Eppendorf 5804R
Centrifuge tubes Corning CLS430829
ChemiDoc MP system Bio-Rad 1708280
Citric acid Sigma-Aldrich 251275
Clear flat.bottom 96-Well Plates Thermo Scientific 3855
Coomassie Brilliant Blue G-250 Bio-Rad #1610406
Coomassie brilliant blue R-250 Bio-Rad 1610400
Dextrose J.T. Baker 1916-01
Ductless Enclosure Labconco Vertical https://imagej.nih.gov/ij ImageJ 1.53c
Gel Doc EZ Bio Rad. Gel Documentation System
Glycerol Sigma-Aldrich G5516-4L
Hemocytometer Marienfeld 650030
ImageJ (Software) NIH, USA Version 1.53c
Incubator 211 Labnet I5211 DS
Methanol J.T. Baker 9049-03
Mini-PROTEAN tetra cell Bio-Rad 1658000EDU
Na2HPO4 J.T. Baker 3824-01
NaCl J.T. Baker 3624-01
NaH2PO4.H2O J.T. Baker 3818-05
Origin software version 9 To design the plot with sigmoidal adjustments
Petridish Falcon 351007
Pipetman kit Gilson F167380
Precast mini gel BioRad 1658004
Prestained Protein Ladder Thermo Scientific 26620
Protease Inhibitor Cocktail Roche 11836153001
Protein Assay Dye Reagent Concentrate Bio-Rad 5000006
Rhodamine 6G Sigma-Aldrich 252433
SDS Sigma-Aldrich L4509
Sodium citrate dihydrate JT Baker 3646-01
Spectrophotometer THERMO SCIENTIFIC G10S UV-VIS
Tris Base Sigma-Aldrich 77-86-1
Volt Power Supply Hoefer PS300B

Referanslar

  1. Frazão, B., Vasconcelos, V., Antunes, A. Sea anemone (Cnidaria, Anthozoa, Actiniaria) toxins: an overview. Marine Drugs. 10 (8), 1812-1851 (2012).
  2. Jayathilake, J. M. N. J., Gunathilake, K. V. K. Cnidarian toxins: recent evidences for potential therapeutic uses. The European Zoological Journal. 87 (1), 708-713 (2020).
  3. Ramírez-Carreto, S., Miranda-Zaragoza, B., Rodríguez-Almazán, C. Actinoporins: From the structure and function to the generation of biotechnological and therapeutic tools. Biomolecules. 10 (4), 539 (2020).
  4. Fautin, D. G. Structural diversity, systematics, and evolution of cnidae. Toxicon. Official Journal of the International Society on Toxinology. 54 (8), 1054-1064 (2009).
  5. Moran, Y., et al. Analysis of soluble protein contents from the nematocysts of a model sea anemone sheds light on venom evolution. Marine Biotechnology. 15 (3), 329-339 (2013).
  6. Moran, Y., et al. Neurotoxin localization to ectodermal gland cells uncovers an alternative mechanism of venom delivery in sea anemones. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 279 (1732), 1351-1358 (2012).
  7. Grabski, A. C. Advances in preparation of biological extracts for protein purification. Methods in Enzymology. 463, 285-303 (2009).
  8. Bulati, M., et al. Partially purified extracts of sea anemone Anemonia viridis affect the growth and viability of selected tumour cell lines. BioMed Research International. 2016, 3849897 (2016).
  9. Orts, D. J. B., et al. Biochemical and electrophysiological characterization of two sea anemone type 1 potassium toxins from a geographically distant population of Bunodosoma caissarum. Marine Drugs. 11 (3), 655-679 (2013).
  10. Hader, D., Erzinger, G. . Bioassays: Advanced Methods and Applications. , (2017).
  11. Anderluh, G., Macek, P. Cytolytic peptide and protein toxins from sea anemones (Anthozoa: Actiniaria). Toxicon: Official Journal of the International Society on Toxinology. 40 (2), 111-124 (2002).
  12. Nevalainen, T. J., et al. Phospholipase A2 in cnidaria. Comparative Biochemistry and Physiology. Part B, Biochemistry & Molecular Biology. 139 (4), 731-735 (2004).
  13. Razpotnik, A., et al. A new phospholipase A2 isolated from the sea anemone Urticina crassicornis – its primary structure and phylogenetic classification. The FEBS Journal. 277 (12), 2641-2653 (2010).
  14. Dennis, E. A., Cao, J., Hsu, Y. -. H., Magrioti, V., Kokotos, G. Phospholipase A2 enzymes: Physical structure, biological function, disease implication, chemical inhibition, and therapeutic intervention. Chemical Reviews. 111 (10), 6130-6185 (2011).
  15. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  16. Kwon, Y. -. C., Jewett, M. C. High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis. Scientific Reports. 5, 8663 (2015).
  17. Eno, A. E., Konya, R. S., Ibu, J. O. Biological properties of a venom extract from the sea anemone, Bunodosoma cavernata. Toxicon: Official Journal of the International Society on Toxinology. 36 (12), 2013-2020 (1998).
  18. Morales-Landa, J. L., et al. Antimicrobial, antiprotozoal, and toxic activities of Cnidarian extracts from the Mexican Caribbean Sea. Pharmaceutical Biology. 45 (1), 37-43 (2007).
  19. Sánchez-Rodríguez, J., Cruz-Vazquez, K. Isolation and biological characterization of neurotoxic compounds from the sea anemone Lebrunia danae (Duchassaing and Michelotti, 1860). Archives of Toxicology. 80 (7), 436-441 (2006).
  20. de Oliveira, J. S., et al. Caissarolysin I (Bcs I), a new hemolytic toxin from the Brazilian sea anemone Bunodosoma caissarum: purification and biological characterization. Biochimica Et Biophysica Acta. 1760 (3), 453-461 (2006).
  21. Norton, R. S., et al. Purification and characterisation of proteins with cardiac stimulatory and haemolytic activity from the anemone Actinia tenebrosa. Toxicon: Official Journal of the International Society on Toxinology. 28 (1), 29-41 (1990).
  22. Gondran, M., Eckeli, A. L., Migues, P. V., Gabilan, N. H., Rodrigues, A. L. S. The crude extract from the sea anemone, Bunodosoma caissarum elicits convulsions in mice: possible involvement of the glutamatergic system. Toxicon: Official Journal of the International Society on Toxinology. 40 (12), 1667-1674 (2002).
  23. Dion, A. S., Pomenti, A. A. Ammoniacal silver staining of proteins: mechanism of glutaraldehyde enhancement. Analytical Biochemistry. 129 (2), 490-496 (1983).
  24. Ramírez-Carreto, S., et al. Identification of a pore-forming protein from sea anemone Anthopleura dowii Verrill (1869) venom by mass spectrometry. The Journal of Venomous Animals and Toxins Including Tropical Diseases. 25, 147418 (2019).
  25. Nelson, G. J. Studies on the lipids of sheep red blood cells. I. Lipid composition in low and high potassium red cells. Lipids. 2 (1), 64-71 (1967).
  26. Ramírez-Carreto, S., et al. Transcriptomic and proteomic analysis of the tentacles and mucus of Anthopleura dowii Verrill, 1869. Marine Drugs. 17 (8), 436 (2019).

Play Video

Bu Makaleden Alıntı Yapın
Ramírez-Carreto, S., Salazar-García, S. I., Macías Martínez, G., Rodríguez-Almazán, C. Identification of Hemolytic and Phospholipase Activity in Crude Extracts from Sea Anemones by Straightforward Bioassays. J. Vis. Exp. (181), e63630, doi:10.3791/63630 (2022).

View Video