Transgenik floresan fareler kullanılarak, canlı hayvanlarda bozulmamış siyatik sinirin motor ve duyusal aksonları içinde sinyal veren endozomların ve mitokondrilerin in vivo aksonal taşınımını değerlendirmek için ayrıntılı protokoller tanımlanmıştır.
Aksonal taşımacılık, çeşitli organellerin ve yüklerin çift yönlü kaçakçılığını sağlayarak nöronal homeostazı korur. Aksonal taşımadaki bozulmalar, bireysel nöronlar ve ağları için yıkıcı sonuçlara sahiptir ve çok sayıda nörolojik bozukluğa katkıda bulunur. Bu koşulların birçoğu hem hücre özerk hem de otonom olmayan mekanizmaları içerdiğinden ve genellikle nöronal alt tipler arasında bir patoloji spektrumu gösterdiğinden, nöronal alt kümeleri doğru bir şekilde tanımlamak ve analiz etmek için yöntemler zorunludur.
Bu yazıda, anestezi uygulanan farelerin siyatik sinirlerinde sinyal veren endozomların ve mitokondrilerin in vivo aksonal taşınımını değerlendirmek için protokoller detaylandırılmıştır. 1) Kolinerjik motor nöronlar içinde floresan proteinleri seçici olarak eksprese eden fareleri kullanarak motoru in vivo, in situ ve ex vivo duyusal nöronlardan ayırt etmek; ve 2) sinyal veren endozomların ve mitokondrilerin in vivo aksonal taşınımını ayrı ayrı veya eşzamanlı olarak değerlendirir. Bu tamamlayıcı intravital yaklaşımlar, sağlık ve hastalıkta aksonal transportu kantitatif olarak izlemek için farklı periferik sinir aksonlarındaki farklı yüklerin eşzamanlı görüntülenmesini kolaylaştırır.
Periferik sinir sistemi (PNS), merkezi sinir sistemini (CNS) distal hedeflerine bağlar ve motor kontrolünü uygulamak için efferent sinyallerin rölesine ve duyusal geri bildirim sağlamak için afferent sinyallerin iletilmesine izin verir. Fare genetiğindeki çok sayıda gelişmeyi kullanarak, bilim adamları PNS 1,2,3’ü etkileyen birçok hastalığı / sendromu araştırmak için farklı fare modelleri geliştirdiler. Çoğu nörodejeneratif patoloji, hücre otonom ve otonom olmayan katkıları4,5 ile multifaktöriyel olduğundan, hücre / nörona özgü patolojilerin çözülmesi, hastalık mekanizmalarına çok önemli, yeni bilgiler sağlayabilir.
Bu amaçla, bakteriyel yapay kromozom (BAC)-transgenik farelerin 6 gelişimi, nöronların hedeflenen alt kümelerinde floresanproteinlerin seçici endojen ekspresyonunu sağlamıştır. Örneğin, kolinerjik7 veya glisinerjik nöronlar8’de yeşil floresan proteini (GFP) veya parvalbümin pozitif nöronlarda9’da bir varyant kırmızı floresan proteini (tdTomato) eksprese eden BAC-transgenik fareler mevcuttur. Alternatif olarak, floresan proteinlerin seçici nöronal ekspresyonu, Cre-loxP teknolojisi10 ile elde edilebilir. Örneğin, nöronların alt kümelerinde Cre-rekombinaz eksprese eden fare suşları (örneğin, kolin asetiltransferaz (ChAT)-Cre), loxP bölgeleri11 tarafından kuşatılmış bir transkripsiyonel baskılayıcının kontrolü altında (örneğin, tdDomates veya GFP) kurucu bir lokustan (örneğin, tdDomates veya GFP) floresan proteini (örneğin, tdDomates veya GFP) eksprese eden farelerle yetiştirilebilir (örneğin, tdDomates’i yalnızca kolinerjik nöronlarda eksprese eden fareler üretmek). Gerçekten de, Cre-loxP rekombinasyonunu kullanarak, inen kortikospinal sistemin aksonlarında sarı floresan proteini eksprese eden transgenik fareler üretilmiştir12.
Ek olarak, ORANGE gibi CRISPR / Cas9 gen düzenlemedeki son gelişmeler, nano ölçekli çözünürlük13’te elde edilebilen ekspresyon ile çoklu endojen nöronal proteinlerin floresan etiketlemesini mümkün kılmaktadır. Dahası, Cre-eksprese eden fare suşları ile kombinasyon halinde, ORANGE-CAKE bireysel nöronlarda birden fazla endojen proteini etiketlemek için kullanılabilir13. Alternatif olarak, viral aracılı nöronal izleme, nöronal alt kümelerin etiketlenmesine de izin verir ve viral serotiplerin ve / veya hücreye özgü promotörlerin hedeflenen kombinasyonları ile elde edilebilir14,15,16,17.
Nöronal etiketleme yöntemlerine ek olarak, fare çizgileri, camgöbeği floresan proteinini (Mito.CFP)18 ifade eden mitokondri veya GFP’yi (LC3.GFP)19 ifade eden otofagozomlar gibi belirli organelleri hedef alan muhabir proteinlerini ifade etmek için de tasarlanmıştır. Dahası, fare çizgileri özellikle nöronlardaki kalsiyum dinamiklerini değerlendirmek için tasarlanmıştır (örneğin, Thy1.GCaMP)20,21. Toplamda, bu tür modellerin ilerlemesiyle, yeni deneysel uygulamalar, bilim adamlarının CNS ve PNS hakkında daha kesin biyolojik ve patolojik sorular sormalarını sağlar.
Periferik motor sinirlerin ana rolü, hareketi ortaya çıkarmak için elektrik sinyallerini iskelet kasına iletmektir. Ek olarak, ve daha uzun zaman ölçeklerinde meydana gelen, çeşitli organeller (örneğin, mitokondri, endolizozomlar, sinyal endozomları) şeklinde nörokimyasal ve fizyolojik mesajlar, nöronal homeostazın korunmasına yardımcı olmak için sitoiskelet ağını tek veya çift yönlü bir şekilde geçer22,23,24. Aksonal transporttaki bozulmaların nöronal sağlık için feci sonuçları vardır ve birçok nörogelişimsel ve nörodejeneratif hastalıkla bağlantılıdır25. Moleküler düzeyde, aksonal taşımadaki bozulmalar, sinaptik sinyalleşmeyi ve plastisiteyi, gen transkripsiyonunu ve akson26,27 boyunca lokal translasyonu düzenleyen fizyolojik olayları bozabilir. Bu olayları kültürlenmiş hücrelerde / nöronlarda incelemek için çok sayıda araç olsa da28,29, aksonal taşıma dinamiklerini ve aksonal bağlantılı biyolojik olayları in vivo olarak değerlendirmek, fizyolojik ve patolojik süreçlere ilişkin temel içgörüleri doğrulamak için gereklidir30.
Yıllar geçtikçe, Schiavo Laboratuvarı aksonal taşıma hakkında çeşitli sorular sormak için protokolleri optimize etmiştir31,32,33,34,35,36. Bu deneyler, tetanoz nörotoksininin (HCT) floresan olarak etiketlenmiş atoksik bir parçasının, nidogenler ve polisialoglio sidleri37 ile etkileşimler yoluyla iskelet kasındaki akson terminallerine içselleştirildiğinin keşfinden genişlemiştir. İçselleştirildikten sonra, HCT, motor ve duyusal nöronların hücre gövdelerine yönelik Rab7-pozitif, nörotrofin içeren sinyal endozomlarında retrograd olarak taşınır 38,39,40,41. Buna paralel olarak, görüntüleme teknolojisindeki ilerlemeler, canlı, anestezi uygulanan farelerde periferik sinir demetlerinin ve bireysel aksonların gerçek zamanlı analizini sağlamıştır30. Patolojide in vivo aksonal transport dinamiklerini değerlendirmeye yönelik ilk girişim, SOD1G93A fare amiyotrofik lateral skleroz (ALS) modelinde sinyal veren endozomların ve mitokondrilerin taşınmasında presemptomatik bozukluklar ortaya koymuştur35. Daha da önemlisi, motor nöron kaybının, Kennedy hastalığı42’nin bir fare modelinde ve ALS43’ün heterozigot mutant FUS modelinde aksonal taşıma pertürbasyonlarının yokluğunda ortaya çıkabileceği bulgusu göz önüne alındığında, bu kusurların nörodejenerasyonun ikincil sonuçlarını temsil etmesi muhtemel değildir. Bu tür aksonal transport açıkları, ALS farelerinde spesifik kinazların inhibitörleri33 veya büyüme faktörü reseptörleri34 kullanılarak düzeltilebilir. Dahası, nöronların spesifik bir histon deasetilaz blokeri ile tedavi edilmesi, mitokondriyal transportu in vivo36 değiştirir. Son zamanlarda, aksonal transportun BDNF’ye bağımlı modülasyonunun, ALS fareleri44’te farklı motor nöron alt tiplerinde düzensiz olduğunu bildiriyoruz.
Aksonal taşıma dinamiklerini değerlendirmek için sürekli genişleyen bir araç seti kullanan bu video protokolü, farklı biyolojik ve patolojik senaryolar hakkında daha fazla bilgi sahibi olmayı sağlayacak çeşitli uygulamaları özetlemektedir. İlk olarak, kolinerjik nöronlarda (yani motor nöronlarda) floresan proteinlerini seçici olarak eksprese eden transgenik fareler, hem in vivo hem de ex vivo motor ve duyusal aksonlar arasında ayrım yapmak için kullanılır. Floresan olarak etiketlenmiş HCT daha sonra farklı periferik nöronlardaki aksonal taşıma dinamiklerini ayırt etmek için üç transgenik çizgideki sinyal endozomlarına yüklenir. Bir sonraki deneysel protokol, ChAT.tdDomates farelerini Mito-CFP fareleri ile yetiştirerek özellikle motor nöronlarda mitokondriyal taşımayı değerlendirmek için çok katlı bir floresan yaklaşımını detaylandırmaktadır. Son olarak, aynı akson içindeki mitokondri ve sinyal endozomlarının in vivo olarak nasıl eşzamanlı olarak görüntüleneceğine dair talimatlar verilmiştir.
Bu protokol, fare siyatik sinirinin sağlam aksonlarında sinyal veren endozomların ve mitokondrilerin in vivo aksonal taşınımını değerlendirmek için adımları detaylandırır. Gerçekten de, kullanıcıların 1) motor nöronlarda seçici olarak ifade edilen floresan muhabir proteinlerini eksprese eden fareleri kullanarak motoru in vivo , in situ ve ex vivo duyusal nöronlardan ayırt etmelerini sağlayan deneysel bir kurulum sağlanmıştır; 2) üç farklı transgenik fare kullanarak özellikle motor nöron aksonlarında sinyal veren endozomların in vivo aksonal taşınımını değerlendirmek; 3) Mitokondrinin özellikle motor nöron aksonlarında in vivo aksonal taşınımını araştırmak; ve 4) aynı akson içindeki sinyal veren endozomların ve mitokondrilerin in vivo taşıma dinamiklerini eşzamanlı olarak değerlendirir. Bu yaklaşım, bazal koşullarda aksonal transportu araştırmak için geniş bir potansiyele sahiptir ve periferik motor ve duyusal sinirleri etkileyen farklı hastalıklarda patolojik pertürbasyonları değerlendirmek için kullanılabilir.
Önceki deneysel paradigmaları temel olarak kullanarak31,32, burada transgenik muhabir fareleri kullanarak motor ve duyusal nöronlarda meydana gelen aksonal taşımayı ayırt etmenin ayrıntılı yeni, sağlam yollarına sahibiz. Mito.CFP fareyi kullanarak, bu yaklaşım TMRE36’nın intrasiyatik sinir enjeksiyonlarından kaçınarak in vivo mitokondriyal transportu değerlendirmek için daha da geliştirilmiştir. Bu, probun intrasinir enjeksiyonunun neden olduğu aksonal taşımadaki olası nöral hasarı ve pertürbasyonları ortadan kaldırır. Ayrıca, bu protokol, farklı fizyolojik özelliklere sahip kasları innerve eden motor aksonlardaki çoklu organellerin aksonal taşınmasının görselleştirilmesine izin verir (örneğin, hızlı seğirme yorulmaya dirençli kaslara karşı hızlı seğirme yorulmaya dirençli kaslar). Bu nedenle, sinyal endozomu ve / veya mitokondriyal aksonal taşıma dinamikleri, α-motor nöronların farklı alt kümelerinde değerlendirilebilir44. Ayrıca, bu organellerin patolojik ortamlarda aksonal taşınması, farklı nörodejeneratif hastalıkların fare modelleri ile melezleme yoluyla da değerlendirilebilir 1,2,3.
Aksonal taşıma araç seti sürekli olarak28,29 genişlemektedir ve kültürlü fare ventral boynuz eksplantları 49 veya eksize edilmiş fare sinir-kas preparatları 50 kullanılarak taşıma dinamiklerini değerlendirmek için ex vivo protokoller geliştirilmiştir. Ayrıca, indüklenmiş insan pluripotent kök hücresi (hiPSC) kaynaklı kortikal 51 nöronlarda veya hiPSC türevi spinal motornöronlarda 52’de aksonal transportu değerlendirmek için protokollerin geliştirilmesi, hastalığa neden olan mutasyonlara sahip insan nöronlarının araştırılmasını sağlamıştır. Fare dokusu ve insan hücrelerindeki bu tür son teknoloji protokoller, nöronal fonksiyon hakkında kritik bilgiler sağlayabilir, nörodejeneratif hastalık modellerinde yeni pathomechanistic keşfi kolaylaştırabilir ve terapötik molekülleri ve stratejileri test etmek için kullanılabilir.
Bu tekniklerin başarılı bir şekilde uygulanması için birkaç kritik adımın izlenmesi gerekmektedir ve protokol bölümünde bazı önemli notlar verilmiştir. İntravital görüntüleme için başlıca gereksinimler, özelleştirilmiş sahne ekine sahip ters çevrilmiş konfokal mikroskop ve anestezi ve optimum sıcaklığı korumak için ekipmandır. Gerçekten de, 1) anestezi indüksiyonu, 2) diseksiyon / doku işleme (yani, siyatik sinirin açığa çıkarılması) ve 3) intravital görüntüleme sırasında anestezinin sürdürülmesi (daha önce 31,32’de ayrıntılı olarak açıklandığı gibi) için özel bir mobil anestezik sisteme ihtiyaç vardır. Özellikle daha yüksek büyütme hedefleri (örneğin, 40x veya 63x) kullanıldığında, anestezi derinliği görüntü kalitesini etkileyebilir, çünkü daha derin anestezi, odakta sık sık kaymalara neden olan büyük ‘gazlı’ nefeslere neden olur. Bu tür büyük hareketler şüphesiz görüntüleme sonrası taşıma analizlerini (örneğin, Fiji eklentileri TrackMate53 veya KymoAnalyzer54 kullanarak kargoların izlenmesi) etkileyecektir, çünkü solunum hareketleri hızlandırılmış videolarda otomatik izleme için uygun olmayan veya daha fazla zaman alıcı değerlendirme gerektirebilecek eserler üretir. Ayrıca, siyatik sinir içindeki titreşen arterlerin neden olduğu, ancak farklı bir görüntüleme bölgesi seçilerek çözülebilen görüntüleme artefaktlarını da gözlemledik. Mikroskop, sıcaklık ve pH’ın aksonal taşımayı etkilediği için sabit vücut sıcaklığını koruyabilen bir çevre odası ile donatılmalıdır55. Ayrıca, ameliyat sonrası analjeziklerin uygulanmasından kaçınılmalıdır, çünkü bunlar taşıma dinamiklerini değiştirebilir56. Deneysel tasarım uzunlamasına ise ve tekrarlanan görüntüleme gerektiriyorsa (örneğin, 57), diseksiyon protokollerinin minimal invaziv olacak şekilde uygun şekilde ayarlanması gerekir ve ek etik / lisans onayı gerektirebilir.
Bazı deneysel hususların akılda tutulması gerekir. İlk olarak, burada ayrıntılı olarak açıklanan protokollerin çoğu, mitokondri veya motor nöron aksonlarında floresan muhabir proteinlerine sahip transgenik farelerin kullanımını içerir. Bu fare çizgilerinin her biri hemi-/heterozigot olarak yetiştirilmeli ve görüntülenmelidir. Bununla birlikte, istisnalar, homozigot olarak ayrı ayrı korunabilen ChAT.Cre ve Rosa26.tdDomates fare çizgileridir ve elde edilen hemizigot yavruları, Cre-loxP rekombinasyonundan sonra kolinerjik nöronlarda tdDomates ekspresyonunu sağlar. Transgenik hemi / heterozigot fareleri (örneğin, Mito.CFP) diğer transgenik hemi / heterozigot farelerle (örneğin, ChAT.eGFP) melezleştirirken, istenen sayıda çift mutant doyunun elde edilmesi zaman alıcı olabileceğinden, üreme stratejisini dikkatlice düşünmek gerekir. Dahası, F1 nesil ChAT.Cre ve Rosa26.tdDomates farelerini (yani, ChAT.tdDomates) ek transgenik suşlarla (örneğin, Mito.CFP) yetiştirirken, istenen üçlü transgenleri taşıyan daha az fare beklenmelidir. Ek olarak, yakın dalga boyu özelliklerine sahip iki muhabirli fareleri yetiştirirken potansiyel florofor örtüşmesi de göz önünde bulundurulmalıdır (örneğin, Mito-CFP-uyarma: 435 nm, emisyon: 485 nm, ChAT.eGFP-uyarma: 488 nm, emisyon: 510 nm ile yetiştirilmiş), ancak spektral karıştırma58 ile bu sorunun üstesinden gelmek mümkün olabilir.
Bu tekniğin dikkate alınması gereken bazı sınırlamaları vardır. Bu çalışmada ve önceki protokollerimiz31,32’de, farklı organelleri in vivo olarak etiketlemek ve izlemek için genetik olarak kodlanmış birkaç belirtecin ve farklı boyama yöntemlerinin nasıl kullanılabileceğini gösterdik. Bununla birlikte, tüm problar bu deneysel yaklaşım için uygun değildir. Kolera toksini beta alt biriminin (CTB)-488 (görüntülemeden 0.5-1.5 μg/μL ~4 saat önce), in vivo retrograd izleyici deneylerinde motor nöron hücre cisimciklerini etiketlemek için rutin olarak kullanılan bir probun TA veya soleus kasına enjeksiyonları değerlendirdik. Bununla birlikte, tek başına enjekte edildiğinde veya HCT-555 ile birlikte enjekte edildiğinde, CTB-488 etiketlemesi, başarılı retrograd motor nöron takibi için kullanılanlara benzer konsantrasyonlar kullanılmasına rağmen zayıftı. Bu nedenle, CTB’nin nöronal kültürlerde sinyal veren endozomların mükemmel bir in vitro belirteci olmasınarağmen, H CT’nin in siyatik sinir aksonlarında in vivo sinyal endozomlarını tanımlamak için altın standart prob olmaya devam ettiği sonucuna varıyoruz.
Farklı yollar kullanarak, LysoTracker yeşil DND-26 gibi lizozomları etiketlemek için rutin olarak kullanılan probları ve Cathepsin D62 için BODIPY-FL-pepstatin A ve Cathepsin B için Magic Red gibi aktif lizozomal hidrolazların belirteçlerini test ettik, ancak başarılı olamadık. BODIPY-FL-pepstatin A’nın intramüsküler olarak verilmesini (görüntülemeden önce TA ~ 4 saat içinde 2.5 μg) ve görüntülemeden 30-60 dakika önce 2 μL LysoTracker (10 μM), BODIPY-FL-pepstatin A (10 μM) veya Magic Red (1/10) intrasiyatik sinir enjeksiyonunu denedik. Siniri vurgulayan bu problara rağmen, açıkça etiketlenmiş organeller bulamadık. Sondalar aksonların etrafında birikti, muhtemelen Schwann hücreleri tarafından tutuldu. Bu nedenle, lizozomların başarısız bir şekilde etiketlenmesi, nöronlara eksik prob verilmesinden kaynaklanabilir, ancak daha uygun konsantrasyonların varlığı göz ardı edilemez. TMRE etiketlemesinin benzer koşullar altında (yani, intrasiyatik sinir enjeksiyonları) çalıştığı göz önüne alındığında, etiketleme yoğunluğu boyaya bağımlı olabilir ve her belirteç için bağımsız olarak test edilmelidir. Bununla birlikte, lizozomları bu problarla in vivo olarak hedeflemenin yukarıda belirtilen konsantrasyonlarda mümkün olmadığı sonucuna varıyoruz.
Anestezi yöntemleri farklı fizyolojik okumaları değiştirebilir (örneğin, koklea fonksiyonu63 ve kortikal elektrofizyoloji64); Bununla birlikte, anestezinin siyatik sinirde in vivo aksonal transportu etkileyip etkilemediği şu anda bilinmemektedir. İzofluran kaynaklı anestezi altında azalmış nöromüsküler aktivite göz önüne alındığında, taşıma kinetiğinin uyanık duruma kıyasla farklılık göstermesi mümkündür. Bununla birlikte, bunu doğrudan araştıran tek in vivo çalışma, talamokortikal projeksiyonlarda yoğun çekirdek veziküllerinin taşınmasının anestezi uygulanan ve uyanık fareler arasında farklılık göstermediğini ortaya koymuştur65. Ayrıca, vahşi tip ve hastalık modeli fareler arasındaki taşımacılıktaki ayrımlar anestezi altında tespit edilebildiği için35,43, izofluran maruziyetinin endozom veya mitokondriyal kaçakçılığı işaret etmede uygunlukların tanımlanmasını engellemediği açıktır.
Bu protokolün aşağıda açıklanan diğer potansiyel uygulamaları vardır. Bu protokolde özetlenen transgenik farelerin (örneğin, Mito.CFP, ChAT.eGFP) nörodejeneratif hastalık fare modelleri 1,2,3 ile ıslahı, nöron alt tipine ve / veya kargoya özgü araştırmaları mümkün kılacaktır. Dahası, yakın zamanda geliştirilen fare Cre hatları66, farklı duyusal akson popülasyonlarında floresan muhabir proteinlerinin görselleştirilmesine de izin verecektir. Örneğin, Rosa26.tdDomates fareleri bir nöropeptit Y reseptörü -2-eksprese edici (Npy2r) ile çaprazlanabilir. Miyelinli A-fiber nosiseptörlerde tdDomates floresansını etkinleştirmek için Cre fare67. Ayrıca, zamansal kontrol, indüklenebilir Cre sistemleri (örneğin, tamoksifen)68 kullanılarak da sağlanabilir. Başka bir potansiyel uygulama, Schwann hücrelerinde floresan muhabir proteinlerini eksprese eden transgenik farelerin mevcudiyetine dayanmaktadır. Gerçekten de, S100-GFP69 ve PLP-GFP70 fareleri, Schwann hücrelerinin in vivo ve / veya in situ görüntülemesini sağlar ve periferik sinir rejenerasyonu sırasında Schwann hücre göçünde yer alan araştırmaların ön saflarında yer almıştır.
Bu uygulamalara ek olarak ve Mito.CFP fareyi tamamlayan, floresan proteinleri mitokondri ve otofagozomlar gibi farklı organellerde eksprese eden birkaç transgenik fare çizgisinin mevcudiyetidir. Örneğin, in vivo mitokondriyal taşımayı araştırmak, mito::mKate2 fare71 veya fotodönüştürülebilir mitoDendra fare57 ile mümkün olabilir. Ayrıca, mitofaji analizleri için pH’a duyarlı mito-Keima fare72 ve mito-QC fare73 kullanılarak in vivo mitophagotom taşınması mümkün olabilir. Ayrıca, karşılaştığımız lizozomal etiketleme zorlukları, LAMP1-GFP’yi eksprese eden fareler kullanılarak, LAMP1’in lizozomlardan farklı endositik organellerde de mevcut olduğu uyarısı ile aşılabilir74.
Özetle, çeşitli transgenik farelerden spesifik periferik sinir aksonlarındaki çeşitli organellerin in vivo aksonal taşınımını değerlendirmek için yeni yollar sağladık. Farklı organellerin eşzamanlı görüntülenmesi, aksonal etkileşimlerin ve mitokondri ve endozomlar75,76 gibi organellerin ortak kaçakçılığının son bulguları göz önüne alındığında, özellikle önemli olacaktır. Sunulan yöntemlerin, aksonların in vivo bazal fizyolojisinin daha iyi anlaşılması ve periferik sinirlerin nörodejenerasyonunu yönlendiren önemli patomekanizmaların çözülmesi için yararlı olacağına inanıyoruz.
The authors have nothing to disclose.
ChAT-eGFP, ChAT.Cre ve Rosa26.tdDomates farelerini paylaştığı için Robert M. Brownstone’a (Queen Square Institute of Neurology, University College London) ve HB9’u paylaştığı için Pietro Fratta’ya (Queen Square Institute of Neurology, University College London) teşekkür ederiz. GFP fare. Elena R. Rhymes, Charlotte J.P. Kremers ve Qiuhan Lang’a (Queen Square Institute of Neurology, University College London) el yazmasının eleştirel okuması için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Motor Nöron Hastalıkları Derneği (İngiltere) (Tosolini / Ekim 20/973-799) (APT), Wellcome Trust Kıdemli Araştırmacı Ödülleri (107116 / Z / 15 / Z ve 223022 / Z / 21 / Z) (GS), İngiltere Demans Araştırma Enstitüsü Vakfı ödülü (GS) tarafından Junior Non-Clinical Fellowship tarafından desteklenmiştir; ve Tıbbi Araştırma Konseyi Kariyer Geliştirme Ödülü (MR / S006990/1) (JNS).
0.2 mL PCR tube | |||
70% (v/v) ethanol in distilled water | |||
AlexaFlour555 C2 maleimide | ThermoFisher Scientific | A-20346 | Can also use AlexaFlour-488 or -647 Maleimide |
B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm9(CAG-tdTomato)Hze/J | Jackson Laboratory | 7909 | Rosa26.tdTomato mice |
B6.Cg-Tg(Hlxb9-GFP)1Tmj/J mice | Jackson Laboratory | 5029 | HB9.GFP mice |
B6.Cg-Tg(Thy1-CFP/COX8A)S2Lich/J mice | Jackson Laboratory | 7967 | Mito.CFP mice |
B6;129S6-Chattm2(cre)Lowl/J mice | Jackson Laboratory | 6410 | ChAT.Cre mice |
Computer with microscope control and image acquisition software | Zeiss | Zen | |
Cotton swab | |||
Desktop centrifuge | |||
Dissecting microscope | |||
Eye lubricant | |||
Fine curved forceps | Dumont | ||
Fine straight forceps | Dumont | ||
Glass coverslip (22 x 64 mm, thickness no. 1) | |||
Graduated, glass micropipette with microliter markings and plunger | Drummond Scientific | 5-000-1001-X10 | |
Hair clippers | |||
Hamilton microliter syringe (701 N, volume 10 μL, needle size 26 s G, bevel tip, needle L 51 mm) | Merck | 20779 | |
HcT-441 | N/A | N/A | See Restani et al., 2012 for more details |
Heating pad | |||
Immersion oil for fluorescent imaging at 37 °C | |||
Inverted confocal microscope with environmental chamber | Zeiss | LSM 780 | Most inverted confocals should be adaptable |
Isoflurane | |||
Isoflurane vaporizer/anesthesia machine with induction cham-ber and mask stabilizer | |||
Magic tape | invisible tape | ||
Micropipette puller | |||
Parafilm | Parafilm | ||
Phosphate-buffered saline (PBS): 137 mM NaCl, 10 mM Na2HPO4, 2.7 mM KCl, 1.8 mM KH2PO4–HCl, pH 7.4 | |||
Recombinant human brain-derived neurotrophic factor (BDNF) | Peprotech | 450-02 | BDNF that can be used to co-inject with HcT-555 |
Saline | |||
Scalpel blade | Dumont | ||
Small spring scissors | Dumont | ||
Surgery/operating microscope | |||
Surgical drape | |||
Surgical suture | |||
Surgical tape | |||
Tg(Chat-EGFP) GH293Gsat/Mmucd mice | MMRRC | 000296-UCD | ChAT.eGFP |
Vortex mixer |