Utilizando ratones fluorescentes transgénicos, se describen protocolos detallados para evaluar el transporte axonal in vivo de endosomas de señalización y mitocondrias dentro de los axones motores y sensoriales del nervio ciático intacto en animales vivos.
El transporte axonal mantiene la homeostasis neuronal al permitir el tráfico bidireccional de diversos orgánulos y cargas. Las interrupciones en el transporte axonal tienen consecuencias devastadoras para las neuronas individuales y sus redes, y contribuyen a una gran cantidad de trastornos neurológicos. Como muchas de estas condiciones involucran mecanismos autónomos y no autónomos celulares, y a menudo muestran un espectro de patología en todos los subtipos neuronales, los métodos para identificar y analizar con precisión los subconjuntos neuronales son imperativos.
Este artículo detalla los protocolos para evaluar el transporte axonal in vivo de endosomas de señalización y mitocondrias en nervios ciáticos de ratones anestesiados. Se proporcionan instrucciones graduales para 1) distinguir las neuronas motoras de las sensoriales in vivo, in situ y ex vivo mediante el uso de ratones que expresan selectivamente proteínas fluorescentes dentro de las neuronas motoras colinérgicas; y 2) evaluar por separado o simultáneamente el transporte axonal in vivo de endosomas de señalización y mitocondrias. Estos enfoques intravitales complementarios facilitan la obtención simultánea de imágenes de diferentes cargas en distintos axones nerviosos periféricos para monitorear cuantitativamente el transporte axonal en la salud y la enfermedad.
El sistema nervioso periférico (SNP) conecta el sistema nervioso central (SNC) a sus objetivos distales, permitiendo la transmisión de señales eferentes para ejercer control motor y señales aferentes para proporcionar retroalimentación sensorial. Utilizando la multitud de avances en genética de ratones, los científicos han desarrollado diferentes modelos de ratones para investigar muchas enfermedades / síndromes que afectan al SNP 1,2,3. Como la mayoría de las patologías neurodegenerativas son multifactoriales con contribuciones celulares autónomas y no autónomas 4,5, desenredar las patologías específicas de células / neuronas puede proporcionar información crucial y novedosa sobre los mecanismos de la enfermedad.
Con este fin, el desarrollo de ratones transgénicos con cromosomas artificiales bacterianos (BAC)6 ha permitido la expresión endógena selectiva de proteínas fluorescentes en subconjuntos específicos de neuronas. Por ejemplo, están disponibles ratones bac-transgénicos, que expresan proteína fluorescente verde (GFP) en neuronas colinérgicas7 o glicinérgicas8, o una variante de proteína fluorescente roja (tdTomato) en neuronas parvalbúmina-positivas9. Alternativamente, la expresión neuronal selectiva de proteínas fluorescentes se puede lograr a través de la tecnología Cre-loxP 10. Por ejemplo, las cepas de ratón que expresan Cre-recombinasa en subconjuntos de neuronas (por ejemplo, colina acetiltransferasa (ChAT)-Cre) se pueden criar con ratones que expresan una proteína fluorescente (por ejemplo, tdTomato o GFP) de un locus constitutivo (por ejemplo, Gt(ROSA)26Sor) bajo el control de un represor transcripcional flanqueado por sitios loxP11 (por ejemplo, generando ratones que expresan tdTomato solo en neuronas colinérgicas). De hecho, utilizando la recombinación de Cre-loxP, se han generado ratones transgénicos que expresan proteína fluorescente amarilla en axones del tracto corticoespinal descendente12.
Además, los avances recientes en la edición de genes CRISPR/Cas9, como ORANGE, permiten el etiquetado fluorescente de múltiples proteínas neuronales endógenas, con una expresión alcanzable a resolución a nanoescala13. Además, en combinación con cepas de ratón que expresan Cre, ORANGE-CAKE se puede utilizar para etiquetar múltiples proteínas endógenas en neuronas individuales13. Alternativamente, el rastreo neuronal mediado por virus también permite el etiquetado de subconjuntos neuronales y se puede lograr con combinaciones dirigidas de serotipos virales y / o promotores específicos de células 14,15,16,17.
Además de los métodos de marcado neuronal, las líneas de ratón también se han diseñado para expresar proteínas reporteras dirigidas a orgánulos específicos, como las mitocondrias que expresan la proteína fluorescente cian (Mito.CFP)18 o los autofagosomas que expresan GFP (LC3.GFP)19. Además, las líneas de ratón han sido diseñadas para evaluar la dinámica del calcio específicamente en las neuronas (por ejemplo, Thy1.GCaMP)20,21. En conjunto, con el avance de tales modelos, las nuevas aplicaciones experimentales permiten a los científicos hacer preguntas biológicas y patológicas más precisas sobre el SNC y el SNP.
El papel principal de los nervios motores periféricos es transmitir señales eléctricas al músculo esquelético para provocar movimiento. Además, y ocurriendo en escalas de tiempo más largas, los mensajes neuroquímicos y fisiológicos en forma de orgánulos diversos (por ejemplo, mitocondrias, endolisosomas, endosomas de señalización) atraviesan la red citoesquelética de manera unidireccional o bidireccional para ayudar a mantener la homeostasis neuronal 22,23,24. Las deficiencias en el transporte axonal tienen consecuencias desastrosas para la salud neuronal y están relacionadas con muchas enfermedades del neurodesarrollo y neurodegenerativas25. A nivel molecular, las deficiencias en el transporte axonal pueden interrumpir los eventos fisiológicos que regulan la señalización sináptica y la plasticidad, la transcripción de genes y la traducción local en todo el axón26,27. Si bien existe una multitud de herramientas para estudiar estos eventos en células/neuronas cultivadas28,29, se requiere evaluar la dinámica del transporte axonal y los eventos biológicos ligados axonales in vivo para confirmar conocimientos clave sobre los procesos fisiológicos y patológicos30.
A lo largo de los años, el Laboratorio Schiavo ha optimizado los protocolos para hacer diversas preguntas sobre el transporte axonal 31,32,33,34,35,36. Estos experimentos se han expandido a partir del descubrimiento de que un fragmento atóxico marcado fluorescentemente de neurotoxina tetánica (HCT) se internaliza en terminales axónicos en el músculo esquelético a través de interacciones con nidogens y polisialogangliósidos37. Una vez internalizada, la HCT se transporta retrógradamente en endosomas de señalización rab7 positivos que contienen neurotrofina y que están destinados a los cuerpos celulares de las neuronas motoras y sensoriales 38,39,40,41. Paralelamente, los avances en la tecnología de imágenes han permitido el análisis en tiempo real de haces nerviosos periféricos y axones individuales en ratones vivos anestesiados30. La primera incursión en la evaluación de la dinámica del transporte axonal in vivo en patología reveló deficiencias presintomáticas en el transporte de endosomas de señalización y mitocondrias en el modelo de ratón SOD1G93A de esclerosis lateral amiotrófica (ELA)35. Es importante destacar que es poco probable que estos defectos representen simplemente consecuencias secundarias de la neurodegeneración, dado el hallazgo de que la pérdida de neuronas motoras puede ocurrir en ausencia de perturbaciones de transporte axonal en un modelo de ratón de la enfermedad de Kennedy42 y un modelo FUS mutante heterocigoto de ELA43. Tales déficits de transporte axonal se pueden remediar en ratones con ELA utilizando inhibidores de quinasas específicas33 o receptores del factor de crecimiento34. Además, el tratamiento de las neuronas con un bloqueador específico de la histona desacetilasa altera el transporte mitocondrial in vivo36. Más recientemente, informamos que la modulación dependiente de BDNF del transporte axonal está desregulada en distintos subtipos de neuronas motoras en ratones conELA 44.
Mediante el uso de un conjunto de herramientas en constante expansión para evaluar la dinámica del transporte axonal 28,29, este protocolo de video describe varias aplicaciones que permitirán una mayor comprensión de diferentes escenarios biológicos y patológicos. En primer lugar, los ratones transgénicos que expresan selectivamente proteínas fluorescentes en las neuronas colinérgicas (es decir, las neuronas motoras) se utilizan para discriminar entre axones motores y sensoriales tanto in vivo como ex vivo. La HCT marcada fluorescentemente se carga en endosomas de señalización en tres líneas transgénicas para diferenciar la dinámica de transporte axonal en distintas neuronas periféricas. El siguiente protocolo experimental detalla un enfoque de fluorescencia multiplex para evaluar el transporte mitocondrial específicamente en neuronas motoras mediante la cría de ratones ChAT.tdTomato con ratones Mito-CFP. Finalmente, se proporcionan instrucciones sobre cómo obtener imágenes simultáneas de mitocondrias y endosomas de señalización dentro del mismo axón in vivo.
Este protocolo detalla los pasos para evaluar el transporte axonal in vivo de endosomas de señalización y mitocondrias en axones intactos del nervio ciático del ratón. De hecho, se proporciona una configuración experimental que permite a los usuarios 1) distinguir las neuronas motoras de las sensoriales in vivo, in situ y ex vivo mediante el uso de ratones que expresan proteínas fluorescentes mensajeras expresadas selectivamente en las neuronas motoras; 2) evaluar el transporte axonal in vivo de endosomas de señalización específicamente en axones de neuronas motoras utilizando tres ratones transgénicos diferentes; 3) investigar el transporte axonal in vivo de mitocondrias específicamente en axones de neuronas motoras; y 4) evaluar simultáneamente la dinámica de transporte in vivo de los endosomas de señalización y las mitocondrias dentro del mismo axón. Este enfoque tiene un gran potencial para investigar el transporte axonal en condiciones basales y se puede utilizar para evaluar perturbaciones patológicas en diferentes enfermedades que afectan a los nervios motores y sensoriales periféricos.
Utilizando paradigmas experimentales anteriores como base31,32, aquí tenemos formas novedosas y robustas de diferenciar el transporte axonal que ocurre en neuronas motoras versus sensoriales utilizando ratones reporteros transgénicos. Utilizando el ratón Mito.CFP, este enfoque se ha desarrollado aún más para evaluar el transporte mitocondrial in vivo evitando las inyecciones de nervios intrasociales de TMRE36. Esto evita posibles daños neuronales y perturbaciones en el transporte axonal causadas por la inyección intranerve de la sonda. Además, este protocolo permite la visualización del transporte axonal de múltiples orgánulos en axones motores que inervan los músculos con distintas propiedades fisiológicas (por ejemplo, músculos fatigables de contracción rápida frente a músculos resistentes a la fatiga de contracción lenta). Como tal, la dinámica de transporte axonal de endosomas y/o mitocondrial de señalización se puede evaluar en diferentes subconjuntos de neuronas α motoras44. Además, el transporte axonal de esos orgánulos en entornos patológicos también puede evaluarse mediante cruzamiento con modelos de ratón de diferentes enfermedades neurodegenerativas 1,2,3.
El kit de herramientas de transporte axonal se está expandiendo continuamente28,29, y se han desarrollado protocolos ex vivo para evaluar la dinámica de transporte utilizando explantes de cuerno ventral de ratón cultivados49 o preparaciones de músculo nervioso de ratón extirpadas50. Además, el desarrollo de protocolos para evaluar el transporte axonal en neuronas51 corticales derivadas de células madre pluripotentes humanas inducidas (hiPSC) o neuronas motoras espinales derivadas de hiPSC52 ha permitido la investigación de neuronas humanas con mutaciones causantes de enfermedades. Tales protocolos de vanguardia en tejido de ratón y células humanas pueden proporcionar información crítica sobre la función neuronal, facilitar el descubrimiento de nuevas enfermedades pathomecanicistas en modelos de enfermedades neurodegenerativas y usarse para probar moléculas y estrategias terapéuticas.
Es necesario seguir varios pasos críticos para la implementación exitosa de estas técnicas, y se han proporcionado algunas notas importantes en la sección de protocolo. Los principales requisitos para las imágenes intravitales son el microscopio confocal invertido con inserto de etapa personalizado y el equipo para mantener la anestesia y la temperatura óptima. De hecho, se necesita un sistema anestésico móvil especializado para 1) la inducción de la anestesia, 2) la disección / procesamiento de tejidos (es decir, la exposición del nervio ciático) y 3) el mantenimiento de la anestesia durante las imágenes intravitales (como se detalló anteriormente en 31,32). Especialmente cuando se utilizan objetivos de aumento más altos (por ejemplo, 40x o 63x), la profundidad de la anestesia puede afectar la calidad de la imagen, ya que la anestesia más profunda induce grandes respiraciones “gaseosas” que resultan en cambios frecuentes en el enfoque. Sin duda, estos grandes movimientos tendrán un impacto en los análisis posteriores al transporte de imágenes (por ejemplo, el seguimiento de cargas utilizando los complementos de Fiji TrackMate53 o KymoAnalyzer54), ya que los movimientos respiratorios producen artefactos en videos de lapso de tiempo que pueden hacerlos inadecuados para el seguimiento automatizado o requerir una evaluación que consuma más tiempo. Además, también hemos observado artefactos de imágenes causados por arterias pulsantes dentro del nervio ciático, que solo se pueden resolver eligiendo una región de imagen diferente. El microscopio debe estar equipado con una cámara ambiental capaz de mantener una temperatura corporal constante, ya que la temperatura y el pH influyen en el transporte axonal55. Además, se debe evitar la aplicación de analgésicos postoperatorios, ya que pueden alterar la dinámica de transporte56. Si el diseño experimental es longitudinal y requiere imágenes repetidas (por ejemplo,57), los protocolos de disección deben ajustarse adecuadamente para ser mínimamente invasivos y pueden requerir una aprobación ética / licencia adicional.
Es necesario tener en cuenta ciertas consideraciones experimentales . En primer lugar, la mayoría de los protocolos detallados en este documento implican el uso de ratones transgénicos que poseen proteínas reporteras fluorescentes en mitocondrias o axones de neuronas motoras. Cada una de estas líneas de ratón debe ser criada e imaginada como hemi-/heterocigoto. Las excepciones, sin embargo, son las líneas de ratón ChAT.Cre y Rosa26.tdTomato que se pueden mantener por separado como homocigotos, con la descendencia de hemicigoto resultante que permite la expresión de tdTomato en neuronas colinérgicas después de la recombinación de Cre-loxP . Cuando se cruzan ratones hemic-/heterocigotos transgénicos (por ejemplo, Mito.CFP) con otros ratones hemi-/heterocigotos transgénicos (por ejemplo, ChAT.eGFP), es necesario considerar cuidadosamente la estrategia de reproducción, ya que obtener el número deseado de progenie doble mutante puede llevar mucho tiempo. Además, al criar la generación F1 de ratones ChAT.Cre y Rosa26.tdTomato (es decir, ChAT.tdTomato) con cepas transgénicas adicionales (por ejemplo, Mito.CFP), se debe esperar aún menos ratones que porten los transgenes triples deseados. Además, también se debe considerar la superposición potencial de fluoróforos cuando se crían ratones de dos reporteros con propiedades de longitud de onda cercanas (por ejemplo, Mito-CFP-excitación: 435 nm, emisión: 485 nm, criados con ChAT.eGFP-excitación: 488 nm, emisión: 510 nm), aunque puede ser posible superar este problema con la desmezcla espectral58.
Esta técnica tiene algunas limitaciones a considerar. En este trabajo y en nuestros protocolos anteriores31,32, hemos demostrado cómo se pueden utilizar varios marcadores codificados genéticamente y diferentes métodos de tinción para etiquetar y rastrear distintos orgánulos in vivo. Sin embargo, no todas las sondas son adecuadas para este enfoque experimental. Evaluamos las inyecciones en ta o músculo sóleo de la subunidad beta de la toxina del cólera (CTB)-488 (0,5-1,5 μg/μL ~4 h antes de la obtención de imágenes), una sonda utilizada rutinariamente para etiquetar cuerpos celulares de neuronas motoras en experimentos in vivo de trazadores retrógrados 59,60. Sin embargo, cuando se inyectó solo o se inyectó conjuntamente con HCT-555, el etiquetado CTB-488 fue deficiente a pesar de usar concentraciones similares a las utilizadas para el rastreo exitoso de la neurona motora retrógrada. Por lo tanto, concluimos que, a pesar de que CTB es un excelente marcador in vitro de endosomas de señalización en cultivos neuronales61, HCT sigue siendo la sonda estándar de oro para identificar endosomas de señalización in vivo en axones de nervios ciáticos.
Utilizando diferentes rutas, también probamos sondas utilizadas rutinariamente para etiquetar lisosomas, como LysoTracker verde DND-26, y marcadores de hidrolasas lisosomales activas, como BODIPY-FL-pepstatina A para Catepsina D62 y Magic Red para Catepsina B, pero sin éxito. Probamos la administración intramuscular de BODIPY-FL-pepstatina A (2,5 μg en la TA ~ 4 h antes de la imagen), así como la inyección del nervio intraciático de 2 μL de LysoTracker (10 μM), BODIPY-FL-pepstatina A (10 μM) o Magic Red (1/10) 30-60 min antes de la imagen. A pesar de que estas sondas resaltan el nervio, no pudimos encontrar orgánulos claramente marcados. Las sondas se acumularon alrededor de los axones, probablemente retenidas por las células de Schwann. Por lo tanto, el etiquetado fallido de los lisosomas puede deberse a una entrega deficiente de la sonda en las neuronas, aunque no se puede descartar la existencia de concentraciones más adecuadas. Dado que el etiquetado TMRE funciona en condiciones similares (es decir, inyecciones de nervios intrasciáticos), la intensidad del etiquetado puede depender del colorante y debe probarse para cada marcador de forma independiente. Sin embargo, concluimos que apuntar a los lisosomas in vivo con estas sondas no es factible en las concentraciones indicadas anteriormente.
Los métodos de anestesia pueden alterar distintas lecturas fisiológicas (por ejemplo, función de la cóclea63 y electrofisiología cortical64); sin embargo, actualmente se desconoce si la anestesia influye en el transporte axonal in vivo en el nervio ciático. Dada la actividad neuromuscular reducida bajo anestesia inducida por isoflurano, es posible que la cinética del transporte difiera en comparación con el estado de vigilia. Sin embargo, el único estudio in vivo que ha investigado directamente esto reveló que el transporte de vesículas de núcleo denso en proyecciones talamocorticales no difiere entre ratones anestesiados y despiertos65. Además, debido a que las distinciones en el transporte entre ratones de tipo salvaje y modelo de enfermedad son detectables bajo anestesia35,43, está claro que la exposición al isoflurano no impide la identificación de perturbaciones en la señalización del endosoma o el tráfico mitocondrial.
Este protocolo tiene otras aplicaciones potenciales, que se han descrito a continuación. La cría de los ratones transgénicos descritos en este protocolo (por ejemplo, Mito.CFP, ChAT.eGFP) con modelosde ratón de enfermedad neurodegenerativa 1,2,3 permitirá investigaciones específicas de subtipos y/o cargas neuronales. Además, las líneas Cre66 de ratón recientemente desarrolladas también permitirían la visualización de proteínas reporteras fluorescentes en distintas poblaciones de axones sensoriales. Por ejemplo, los ratones Rosa26.tdTomato se pueden cruzar con un neuropéptido que expresa el receptor Y-2 (Npy2r). Cre mouse para permitir la fluorescencia de tdTomato en nociceptores mielinizados de fibra A67. Además, el control temporal también se puede lograr mediante el uso de sistemas Cre inducibles (por ejemplo, tamoxifeno)68. Otra aplicación potencial se basa en la disponibilidad de ratones transgénicos que expresan proteínas fluorescentes en las células de Schwann. De hecho, los ratones S100-GFP69 y PLP-GFP70 permiten obtener imágenes in vivo y / o in situ de las células de Schwann y han estado a la vanguardia de la investigación involucrada en la migración de células de Schwann durante la regeneración nerviosa periférica.
Además de estas aplicaciones y complementando al ratón Mito.CFP está la disponibilidad de varias líneas de ratones transgénicos que expresan proteínas fluorescentes en distintos orgánulos, como mitocondrias y autofagosomas. Por ejemplo, la investigación del transporte mitocondrial in vivo podría ser posible con el ratón mito::mKate271 o el ratón mitoDendra fotoconvertible57. Además, el transporte de mitofagosomas in vivo puede ser posible utilizando el ratón mito-Keima sensible al pH72 y el ratón mito-QC73 para análisis de mitofagia. Además, las dificultades de marcado lisosomal que encontramos pueden superarse mediante el uso de ratones que expresan LAMP1-GFP, con la advertencia de que LAMP1 también está presente en orgánulos endocíticos distintos de los lisosomas74.
En resumen, hemos proporcionado nuevas formas de evaluar el transporte axonal in vivo de varios orgánulos en axones nerviosos periféricos específicos de diversos ratones transgénicos. La imagen concurrente de diferentes orgánulos será particularmente importante, dados los recientes hallazgos de interacciones axonales y corretaje de orgánulos como mitocondrias y endosomas75,76. Creemos que los métodos presentados serán útiles para mejorar la comprensión de la fisiología basal de los axones in vivo y desenredar importantes mecanismos pathomecanismos que impulsan la neurodegeneración de los nervios periféricos.
The authors have nothing to disclose.
Nos gustaría agradecer a Robert M. Brownstone (Queen Square Institute of Neurology, University College London) por compartir los ratones ChAT-eGFP, ChAT.Cre y Rosa26.tdTomato, y a Pietro Fratta (Queen Square Institute of Neurology, University College London) por compartir el HB9. Ratón GFP. Nos gustaría agradecer a Elena R. Rhymes, Charlotte J.P. Kremers y Qiuhan Lang (Queen Square Institute of Neurology, University College London) por la lectura crítica del manuscrito. Este trabajo fue apoyado por una beca junior no clínica de la Asociación de Enfermedades de la Neurona Motora (Reino Unido) (Tosolini / Oct20 / 973-799) (APT), los Premios wellcome Trust senior Investigator Awards (107116 / Z / 15 / Z y 223022 / Z / 21 / Z) (GS), un premio de la Fundación del Instituto de Investigación de demencia del Reino Unido (GS); y un Premio al Desarrollo Profesional del Consejo de Investigación Médica (MR/S006990/1) (JNS).
0.2 mL PCR tube | |||
70% (v/v) ethanol in distilled water | |||
AlexaFlour555 C2 maleimide | ThermoFisher Scientific | A-20346 | Can also use AlexaFlour-488 or -647 Maleimide |
B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm9(CAG-tdTomato)Hze/J | Jackson Laboratory | 7909 | Rosa26.tdTomato mice |
B6.Cg-Tg(Hlxb9-GFP)1Tmj/J mice | Jackson Laboratory | 5029 | HB9.GFP mice |
B6.Cg-Tg(Thy1-CFP/COX8A)S2Lich/J mice | Jackson Laboratory | 7967 | Mito.CFP mice |
B6;129S6-Chattm2(cre)Lowl/J mice | Jackson Laboratory | 6410 | ChAT.Cre mice |
Computer with microscope control and image acquisition software | Zeiss | Zen | |
Cotton swab | |||
Desktop centrifuge | |||
Dissecting microscope | |||
Eye lubricant | |||
Fine curved forceps | Dumont | ||
Fine straight forceps | Dumont | ||
Glass coverslip (22 x 64 mm, thickness no. 1) | |||
Graduated, glass micropipette with microliter markings and plunger | Drummond Scientific | 5-000-1001-X10 | |
Hair clippers | |||
Hamilton microliter syringe (701 N, volume 10 μL, needle size 26 s G, bevel tip, needle L 51 mm) | Merck | 20779 | |
HcT-441 | N/A | N/A | See Restani et al., 2012 for more details |
Heating pad | |||
Immersion oil for fluorescent imaging at 37 °C | |||
Inverted confocal microscope with environmental chamber | Zeiss | LSM 780 | Most inverted confocals should be adaptable |
Isoflurane | |||
Isoflurane vaporizer/anesthesia machine with induction cham-ber and mask stabilizer | |||
Magic tape | invisible tape | ||
Micropipette puller | |||
Parafilm | Parafilm | ||
Phosphate-buffered saline (PBS): 137 mM NaCl, 10 mM Na2HPO4, 2.7 mM KCl, 1.8 mM KH2PO4–HCl, pH 7.4 | |||
Recombinant human brain-derived neurotrophic factor (BDNF) | Peprotech | 450-02 | BDNF that can be used to co-inject with HcT-555 |
Saline | |||
Scalpel blade | Dumont | ||
Small spring scissors | Dumont | ||
Surgery/operating microscope | |||
Surgical drape | |||
Surgical suture | |||
Surgical tape | |||
Tg(Chat-EGFP) GH293Gsat/Mmucd mice | MMRRC | 000296-UCD | ChAT.eGFP |
Vortex mixer |