Usando camundongos fluorescentes transgênicos, protocolos detalhados são descritos para avaliar o transporte in vivo axonal de endosários e mitocôndrias dentro de axônios motores e sensoriais do nervo ciático intacto em animais vivos.
O transporte axonal mantém a homeostase neuronal, possibilitando o tráfico bidirecional de diversas organelas e cargas. Interrupções no transporte axonal têm consequências devastadoras para os neurônios individuais e suas redes, e contribuem para uma infinidade de distúrbios neurológicos. Como muitas dessas condições envolvem mecanismos autônomos e não autônomos celulares, e muitas vezes exibem um espectro de patologia entre subtipos neuronais, métodos para identificar e analisar com precisão subconjuntos neuronais são imperativos.
Este artigo detalha protocolos para avaliar o transporte axonal in vivo de endosários de sinalização e mitocôndrias em nervos ciáticos de camundongos anestesiados. Instruções stepwise são fornecidas a 1) distinguir motor de neurônios sensoriais in vivo, in situ e ex vivo , utilizando camundongos que expressam seletivamente proteínas fluorescentes dentro de neurônios motores colinérgicos; e 2) avaliar separadamente ou simultaneamente o transporte axonal in vivo de endosários e mitocôndrias de sinalização. Essas abordagens intravitais complementares facilitam a imagem simultânea de diferentes cargas em axônios nervosos periféricos distintos para monitorar quantitativamente o transporte axonal em saúde e doenças.
O sistema nervoso periférico (PNS) conecta o sistema nervoso central (SNC) aos seus alvos distais, permitindo que o relé de sinais eferentes exerça controle motor e sinais diferentes para fornecer feedback sensorial. Usando a infinidade de avanços na genética dos camundongos, os cientistas desenvolveram diferentes modelos de camundongos para investigar muitas doenças/síndromes que afligem a PNS 1,2,3. Como a maioria das patologias neurodegenerativas são multifatoriais com contribuições autônomas celulares e não autônomas 4,5, desembaraçar patologias específicas de células/neurônios pode fornecer novas percepções cruciais sobre mecanismos de doença.
Para isso, o desenvolvimento de cromossomo artificiais bacterianos (BAC)-transgênicos camundongos6 permitiu a expressão endógena seletiva de proteínas fluorescentes em subconjuntos direcionados de neurônios. Por exemplo, camundongos BAC-transgênicos estão disponíveis, que expressam proteína fluorescente verde (GFP) em neurônios colinérgicos7 ou glicocinérgicos8, ou uma variante de proteína fluorescente vermelha (tdTomato) em neurônios parvalbumina-positivos9. Alternativamente, a expressão neuronal seletiva de proteínas fluorescentes pode ser alcançada através da tecnologia Cre-loxP 10. Por exemplo, cepas de camundongos expressando Cre-recombinase em subconjuntos de neurônios (por exemplo, acetiltransferase de colina (ChAT)-Cre) podem ser criadas com camundongos que expressam uma proteína fluorescente (por exemplo, tdTomato ou GFP) de um lócus constitutivo (por exemplo, Gt(ROSA)26Sor) sob o controle de um repressor transcricional ladeado pelos locais loxP11 (por exemplo, gerando ratos que expressam tdTomato apenas em neurônios colinérgicos). De fato, usando a recombinação Cre-loxP, foram gerados camundongos transgênicos que expressam proteína fluorescente amarela em axônios do trato corticospinaldescendente 12.
Além disso, os recentes avanços na edição de genes CRISPR/Cas9, como o ORANGE, permitem a marcação fluorescente de múltiplas proteínas neuronais endógenas, com expressão alcançável na resolução de nanoescala13. Além disso, em combinação com cepas de camundongos que expressam Cre, orange-cake pode ser usado para marcar múltiplas proteínas endógenas em neurônios individuais13. Alternativamente, o rastreamento neuronal mediado por virais também permite a rotulagem de subconjuntos neuronais e pode ser alcançado com combinações direcionadas de sorotipos virais e/ou promotores específicos de células 14,15,16,17.
Além dos métodos de rotulagem neuronal, as linhas de camundongos também foram projetadas para expressar proteínas repórteres direcionadas a organelas específicas, como mitocôndrias expressando proteína fluorescente de ciano (Mito.CFP)18 ou autofagossos expressando GFP (LC3.GFP)19. Além disso, as linhas de camundongos foram projetadas para avaliar a dinâmica do cálcio especificamente em neurônios (por exemplo, Thy1.GCaMP)20,21. Ao todo, com o avanço desses modelos, novas aplicações experimentais permitem aos cientistas fazer perguntas biológicas e patológicas mais precisas sobre o CNS e a PNS.
O principal papel dos nervos motores periféricos é transmitir sinais elétricos ao músculo esquelético para provocar movimentos. Além disso, e ocorrendo em escalas de tempo mais longas, mensagens neuroquímicas e fisiológicas na forma de organelas diversas (por exemplo, mitocôndrias, endólises, endossomos, endomentosomos) atravessam a rede citoesqueletal de forma uni ou bidirecional para ajudar a manter a homeostase neuronal 22,23,24. Os prejuízos no transporte axonal têm consequências desastrosas para a saúde neuronal e estão ligados a muitas doenças neurodesenvolvimentares e neurodegenerativas25. No nível molecular, os prejuízos no transporte axonal podem interromper eventos fisiológicos que regulam a sinalização sináptica e a plasticidade, transcrição genética e tradução local ao longo do axônio26,27. Embora exista uma infinidade de ferramentas para estudar esses eventos em células/neurônios cultivados28,29, avaliar a dinâmica do transporte axonal e eventos biológicos ligados axonal in vivo são necessários para confirmar insights-chave sobre processos fisiológicos e patológicos30.
Ao longo dos anos, o Laboratório Schiavo otimizou protocolos para tirar diversas dúvidas sobre o transporte axonal 31,32,33,34,35,36. Esses experimentos expandiram-se a partir da descoberta de que um fragmento atóxico fluorescentemente rotulado de neurotoxina tétano (HCT) é internalizado em terminais de axônio no músculo esquelético através de interações com nidogens e polisialogangliosides37. Uma vez internalizado, HCT é retrógradamente transportado em rab7-positivo, neurotrophin-contendo endossósias que são destinados para os corpos celulares de neurônios motores e sensoriais 38,39,40,41. Em paralelo, os avanços na tecnologia de imagem permitiram a análise em tempo real de feixes nervosos periféricos e axônios individuais em ratos vivos e anestesiados30. A primeira incursão na avaliação da dinâmica do transporte axonal in vivo na patologia revelou prejuízos pré-síntomicos no transporte de endosários de sinalização e mitocôndrias no modelo de camundongos SOD1G93A de esclerose lateral amiotrófica (ELA)35. É importante ressaltar que esses defeitos dificilmente representarão simplesmente consequências secundárias da neurodegeneração, dado a constatação de que a perda de neurônios motores pode ocorrer na ausência de perturbações de transporte axonal em um modelo de rato da doença de Kennedy42 e um modelo de FUS mutante heterozigoso de ALS43. Esses déficits de transporte axonal podem ser corrigidos em camundongos da ALS usando inibidores de quinases específicas33 ou receptores de fator de crescimento34. Além disso, tratar neurônios com um bloqueador de histone deacetilado específico altera o transporte mitocondrial in vivo36. Mais recentemente, relatamos que a modulação dependente de BDNF do transporte axonal é desregulada em subtipos distintos de neurônios motores em camundongosALS 44.
Usando um kit de ferramentas em constante expansão para avaliar a dinâmica do transporte axonal 28,29, este protocolo de vídeo descreve várias aplicações que permitirão mais insights sobre diferentes cenários biológicos e patológicos. Em primeiro lugar, camundongos transgênicos que expressam seletivamente proteínas fluorescentes em neurônios colinérgicos (ou seja, neurônios motores) são usados para discriminar entre axônios motores e sensoriais tanto in vivo quanto ex vivo. HCT fluorescentemente rotulado é então carregado em endossóis de sinalização em três linhas transgênicas para diferenciar a dinâmica de transporte axonal em neurônios periféricos distintos. O próximo protocolo experimental detalha uma abordagem de fluorescência multiplex para avaliar o transporte mitocondrial especificamente em neurônios motores, criando camundongos ChAT.tdTomato com camundongos Mito-CFP. Finalmente, são fornecidas instruções sobre como imaginar simultaneamente mitocôndrias e endossários de sinalização dentro do mesmo axônio in vivo.
Este protocolo detalha etapas para avaliar o transporte axonal in vivo de endosários de sinalização e mitocôndrias em axônios intactos do nervo ciático do camundongo. De fato, é fornecida uma configuração experimental que permite aos usuários distinguir motor de neurônios sensoriais in vivo, in situ e ex vivo , usando camundongos expressando proteínas fluorescentes de repórteres seletivamente expressas em neurônios motores; 2) avaliar in vivo o transporte axonal de endossóis de sinalização especificamente em axônios neurônios motores utilizando três camundongos transgênicos diferentes; 3) investigar in vivo o transporte axonal de mitocôndrias especificamente em axônios de neurônios motores; e 4) avaliar simultaneamente a dinâmica de transporte in vivo de endosários e mitocôndrias dentro do mesmo axônio. Esta abordagem tem grande potencial para investigar o transporte axonal em condições basais e pode ser usada para avaliar perturbações patológicas em diferentes doenças que afetam os nervos motores e sensoriais periféricos.
Usando paradigmas experimentais anteriores como base31,32, aqui temos novas e robustas formas detalhadas de diferenciar o transporte axonal que ocorre em neurônios motores versus sensoriais usando ratos repórteres transgênicos. Utilizando o mouse Mito.CFP, esta abordagem foi desenvolvida para avaliar o transporte mitocondrial in vivo, evitando injeções nervosas intrascáticas de TMRE36. Isso contorna possíveis danos neurais e perturbações no transporte axonal causados pela injeção intranerve da sonda. Além disso, este protocolo permite a visualização do transporte axonal de múltiplas organelas em axônios motores invasando músculos com propriedades fisiológicas distintas (por exemplo, músculos fatigable de contração rápida vs. músculos resistentes à fadiga de contração lenta). Como tal, a sinalização de dinâmica de transporte axonal e/ou mitocondrial pode ser avaliada em diferentes subconjuntos de neurônios α-motores44. Além disso, o transporte axonal dessas organelas em ambientes patológicos também pode ser avaliado através de cruzamentos com modelos de camundongos de diferentes doenças neurodegenerativas 1,2,3.
O kit de ferramentas de transporte axonal está continuamente expandindo28,29, e protocolos ex vivo foram desenvolvidos para avaliar a dinâmica de transporte usando explantas de chifre ventral de rato49 ou preparações nervosas de camundongosexcisadas 50. Além disso, o desenvolvimento de protocolos para avaliar o transporte axonal em células-tronco pluripotentes humanas induzidas (hiPSC) derivados de51 neurônios ou neurônios motores espinhais derivados do hiPSC52 permitiu a investigação de neurônios humanos com mutações causadoras de doenças. Tais protocolos de ponta no tecido do camundongo e células humanas podem fornecer insights críticos sobre a função neuronal, facilitar a descoberta pathomecanística em modelos de doenças neurodegenerativas e serem usados para testar moléculas e estratégias terapêuticas.
Várias etapas críticas precisam ser seguidas para a implementação bem-sucedida dessas técnicas, e algumas notas importantes foram fornecidas na seção de protocolo. Os principais requisitos para a imagem intravital são o microscópio confocal invertido com inserção de palco personalizada e o equipamento para manter anestesia e temperatura ideal. De fato, é necessário um sistema anestésico móvel especializado para 1) indução de anestesia, 2) dissecção/processamento tecidual (ou seja, expondo o nervo ciático) e 3) mantendo a anestesia durante a imagem intravital (como detalhado anteriormente em 31,32). Especialmente quando se usa objetivos de ampliação mais elevados (por exemplo, 40x ou 63x), a profundidade da anestesia pode impactar a qualidade da imagem, uma vez que anestesia mais profunda induz grandes respirações ‘gaspy’ que resultam em mudanças frequentes de foco. Tais grandes movimentos, sem dúvida, impactarão as análises de transporte pós-imagem (por exemplo, o rastreamento de cargas usando os plugins De Fiji TrackMate53 ou KymoAnalyzer54) à medida que os movimentos respiratórios produzem artefatos em vídeos de lapso de tempo que podem torná-los inadequados para rastreamento automatizado ou requerem uma avaliação mais demorada. Além disso, também observamos artefatos de imagem causados por artérias pulsantes dentro do nervo ciático, que só podem ser resolvidos escolhendo uma região de imagem diferente. O microscópio deve ser equipado com uma câmara ambiental capaz de manter a temperatura corporal constante, pois a temperatura e o pH influenciam o transporte axonal55. Além disso, deve-se evitar a aplicação de analgésicos pós-cirurgia, pois podem alterar a dinâmica do transporte56. Se o projeto experimental é longitudinal e requer imagens repetidas (por exemplo,57), os protocolos de dissecção precisam ser ajustados adequadamente para serem minimamente invasivos e podem exigir aprovação ética/licença adicional.
Certas considerações experimentais precisam ser mantidas em mente. Em primeiro lugar, a maioria dos protocolos aqui detalhados envolvem o uso de camundongos transgênicos que possuem proteínas fluorescentes de repórteres em mitocôndrias ou axônios de neurônios motores. Cada uma dessas linhas de rato deve ser criada e imagem como hemi/heterozigoto. As exceções, no entanto, são as linhas de camundongos ChAT.Cre e Rosa26.tdTomato que podem ser mantidas separadamente como homozigoas, com a prole hemizgota resultante permitindo a expressão tdTomato em neurônios colinérgicos após a recombinação cre-loxP . Quando camundongos transgênicos transgênicos (por exemplo, Mito.CFP) com outros camundongos hemi/heterozigotos transgênicos (por exemplo, ChAT.eGFP), é preciso considerar cuidadosamente a estratégia de reprodução, pois obter os números desejados de prole duplo-mutante pode ser demorado. Além disso, ao criar a geração F1 de camundongos ChAT.Cre e Rosa26.tdTomato (ou seja, ChAT.tdTomato) com cepas transgênicas adicionais (por exemplo, Mito.CFP), deve-se esperar ainda menos camundongos carregando os transgenes triplos desejados. Além disso, deve-se considerar também a potencial sobreposição fluorópica ao criar camundongos de dois repórteres com propriedades de comprimento de onda próximas (por exemplo, Mito-CFP-excitação: 435 nm, emissão: 485 nm, criado com ChAT.eGFP-excitação: 488 nm, emissão: 510 nm), embora possa ser possível superar esse problema com espectral desmusar58.
Essa técnica tem algumas limitações a serem consideradas. Neste trabalho e em nossos protocolos anteriores31,32, mostramos como vários marcadores geneticamente codificados e diferentes métodos de coloração podem ser usados para rotular e rastrear organelas distintas in vivo. No entanto, nem todas as sondas são adequadas para esta abordagem experimental. Avaliamos injeções em ta ou músculo soleus de subunidade beta de cólera (CTB)-488 (0,5-1,5 μg/μL ~4 h antes da imagem), uma sonda rotineiramente usada para rotular corpos celulares neurônios motores em experimentos rastreadores in vivo retrógrados59,60. No entanto, quando injetado sozinho ou co-injetado com HCT-555, a rotulagem CTB-488 foi fraca, apesar de usar concentrações semelhantes às usadas para rastreamento de neurônio motor retrógrado bem sucedido. Assim, concluímos que, apesar do CTB ser um excelente marcador in vitro de endosários de sinalização nas culturas neuronais61, HCT continua sendo a sonda padrão-ouro para identificar endossóis de sinalização in vivo em axônios nervosos ciáticos.
Usando diferentes rotas, também testamos sondas rotineiramente usadas para rotular lysosomes, como LysoTracker verde DND-26, e marcadores de hidrolases lyosômicas ativas, como BODIPY-FL-pepstatin A para Cathepsin D62 e Magic Red para Cathepsin B, mas sem sucesso. Tentamos a entrega intramuscular de BODIPY-FL-pepstatin A (2,5 μg no TA ~4 h antes da imagem), bem como injeção de nervo intrascático de 2 μL de LysoTracker (10 μM), BODIPY-FL-pepstatin A (10 μM) ou Vermelho Mágico (1/10) 30-60 min antes da imagem. Apesar dessas sondas que destacam o nervo, não conseguimos encontrar organelas claramente rotuladas. As sondas se acumularam em torno de axônios, provavelmente sendo retidos por células Schwann. Assim, a rotulagem mal sucedida de lysososomes pode ser devido à entrega deficiente da sonda em neurônios, embora a existência de concentrações mais adequadas não possa ser descartada. Dado que a rotulagem TMRE funciona em condições semelhantes (ou seja, injeções intrascáticas do nervo), a intensidade de rotulagem pode ser dependente de corante e deve ser testada para cada marcador independentemente. No entanto, concluímos que o direcionamento de lysossomes in vivo com essas sondas não é viável nas concentrações acima indicadas.
Métodos de anestesia podem alterar leituras fisiológicas distintas (por exemplo, função de cóclea63 e eletrofisiologia cortical64); no entanto, se a anestesia influencia no transporte axonal vivo no nervo ciático é atualmente desconhecida. Dada a atividade neuromuscular reduzida sob anestesia induzida por isoflurano, é possível que a cinética de transporte difere em comparação com o estado de vigília. No entanto, o único estudo in vivo que investigou diretamente isso revelou que o transporte de vesículas densas em projeções thalamocorticas não difere entre camundongos anestesiados e acordados65. Além disso, como distinções no transporte entre camundongos do tipo selvagem e modelo de doença são detectáveis sob anestesia35,43, é evidente que a exposição isoflurane não impede a identificação de perturbações na sinalização de tráfico endosomo ou mitocondrial.
Este protocolo tem outras aplicações potenciais, que foram descritas abaixo. A criação dos camundongos transgênicos descritos neste protocolo (por exemplo, Mito.CFP, ChAT.eGFP) com modelos de camundongos de doença neurodegenerativa 1,2,3 permitirá investigações específicas do subtipo e/ou de carga. Além disso, o rato recém-desenvolvido Cre lines66 também permitiria a visualização de proteínas fluorescentes de repórteres em distintas populações de axônio sensorial. Por exemplo, camundongos Rosa26.tdTomato podem ser cruzados com um receptor neuropeptídeo Y-2-expressing (Npy2r). Rato cre para habilitar fluorescência tdTomato em nociceptores de fibra A mielique67. Além disso, o controle temporal também pode ser alcançado usando sistemas cre indutíveis (por exemplo, tamoxifen)68. Outra aplicação em potencial depende da disponibilidade de camundongos transgênicos expressando proteínas fluorescentes em células Schwann. De fato, os camundongos S100-GFP69 e PLP-GFP70 permitem imagens in vivo e/ou in situ de células Schwann e estiveram na vanguarda das pesquisas envolvidas na migração celular de Schwann durante a regeneração nervosa periférica.
Além dessas aplicações e complementando o mouse Mito.CFP está a disponibilidade de várias linhas de camundongos transgênicos que expressam proteínas fluorescentes em organelas distintas, como mitocôndrias e autofagontos. Por exemplo, investigar o transporte mitocondrial in vivo pode ser possível com o rato mito::mKate271 ou o fotoconvertível mitoDendra mouse57. Além disso, o transporte mitofagoso in vivo pode ser possível usando o rato mito-Keima sensível ao pH72 e o rato mito-QC73 para análises de mitofagia. Além disso, as dificuldades de rotulagem lysosômicas que encontramos podem ser superadas pelo uso de camundongos expressando LAMP1-GFP, com a ressalva de que lamp1 também está presente em organelas endocíticas distintas dos lysosomos74.
Em resumo, fornecemos novas formas de avaliar o transporte in vivo axonal de várias organelas em axônios periféricos específicos de diversos camundongos transgênicos. A imagem simultânea de diferentes organelas será particularmente importante, dado os recentes achados de interações axonais e co-tráfico de organelas como mitocôndrias e endósmosos75,76. Acreditamos que os métodos apresentados serão úteis para melhorar a compreensão da fisiologia basal dos axônios in vivo e desessencantar importantes mecanismos que conduzem a neurodegeneração dos nervos periféricos.
The authors have nothing to disclose.
Gostaríamos de agradecer a Robert M. Brownstone (Queen Square Institute of Neurology, University College London) por compartilhar os ratos ChAT-eGFP, ChAT.Cre e Rosa26.tdTomato, e Pietro Fratta (Queen Square Institute of Neurology, University College London) por compartilhar o HB9. Mouse GFP. Gostaríamos de agradecer a Elena R. Rhymes, Charlotte J.P. Kremers e Qiuhan Lang (Queen Square Institute of Neurology, University College London) pela leitura crítica do manuscrito. Este trabalho foi apoiado por uma Bolsa Não Clínica Júnior da Associação de Doenças do Neurônio Motor (Reino Unido) (Tosolini/Out20/973-799) (APT), o Wellcome Trust Senior Investigator Awards (107116/Z/15/Z e 223022/Z/21/Z) (GS), um prêmio da Fundação Instituto de Pesquisa de Demência do Reino Unido (GS); e prêmio de Desenvolvimento de Carreira do Conselho de Pesquisa Médica (MR/S006990/1) (JNS).
0.2 mL PCR tube | |||
70% (v/v) ethanol in distilled water | |||
AlexaFlour555 C2 maleimide | ThermoFisher Scientific | A-20346 | Can also use AlexaFlour-488 or -647 Maleimide |
B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm9(CAG-tdTomato)Hze/J | Jackson Laboratory | 7909 | Rosa26.tdTomato mice |
B6.Cg-Tg(Hlxb9-GFP)1Tmj/J mice | Jackson Laboratory | 5029 | HB9.GFP mice |
B6.Cg-Tg(Thy1-CFP/COX8A)S2Lich/J mice | Jackson Laboratory | 7967 | Mito.CFP mice |
B6;129S6-Chattm2(cre)Lowl/J mice | Jackson Laboratory | 6410 | ChAT.Cre mice |
Computer with microscope control and image acquisition software | Zeiss | Zen | |
Cotton swab | |||
Desktop centrifuge | |||
Dissecting microscope | |||
Eye lubricant | |||
Fine curved forceps | Dumont | ||
Fine straight forceps | Dumont | ||
Glass coverslip (22 x 64 mm, thickness no. 1) | |||
Graduated, glass micropipette with microliter markings and plunger | Drummond Scientific | 5-000-1001-X10 | |
Hair clippers | |||
Hamilton microliter syringe (701 N, volume 10 μL, needle size 26 s G, bevel tip, needle L 51 mm) | Merck | 20779 | |
HcT-441 | N/A | N/A | See Restani et al., 2012 for more details |
Heating pad | |||
Immersion oil for fluorescent imaging at 37 °C | |||
Inverted confocal microscope with environmental chamber | Zeiss | LSM 780 | Most inverted confocals should be adaptable |
Isoflurane | |||
Isoflurane vaporizer/anesthesia machine with induction cham-ber and mask stabilizer | |||
Magic tape | invisible tape | ||
Micropipette puller | |||
Parafilm | Parafilm | ||
Phosphate-buffered saline (PBS): 137 mM NaCl, 10 mM Na2HPO4, 2.7 mM KCl, 1.8 mM KH2PO4–HCl, pH 7.4 | |||
Recombinant human brain-derived neurotrophic factor (BDNF) | Peprotech | 450-02 | BDNF that can be used to co-inject with HcT-555 |
Saline | |||
Scalpel blade | Dumont | ||
Small spring scissors | Dumont | ||
Surgery/operating microscope | |||
Surgical drape | |||
Surgical suture | |||
Surgical tape | |||
Tg(Chat-EGFP) GH293Gsat/Mmucd mice | MMRRC | 000296-UCD | ChAT.eGFP |
Vortex mixer |