С использованием трансгенных флуоресцентных мышей описаны подробные протоколы для оценки in vivo аксонального транспорта сигнальных эндосом и митохондрий в моторных и сенсорных аксонах интактного седалищного нерва у живых животных.
Аксональный транспорт поддерживает нейрональный гомеостаз, обеспечивая двунаправленный трафик различных органелл и грузов. Нарушения в аксональном транспорте имеют разрушительные последствия для отдельных нейронов и их сетей и способствуют множеству неврологических расстройств. Поскольку многие из этих состояний включают как автономные, так и неавтономные механизмы клеток и часто демонстрируют спектр патологии по подтипам нейронов, методы точной идентификации и анализа нейронных подмножеств являются обязательными.
В этой статье подробно описываются протоколы оценки in vivo аксонального транспорта сигнальных эндосом и митохондрий в седалищных нервах анестезируемых мышей. Пошаговые инструкции приведены для 1) отличить двигательные нейроны от сенсорных in vivo, in situ и ex vivo с помощью мышей, которые избирательно экспрессируют флуоресцентные белки в холинергических двигательных нейронах; и 2) отдельно или одновременно оценивать in vivo аксональный транспорт сигнальных эндосом и митохондрий. Эти дополнительные прижизненные подходы облегчают одновременную визуализацию различных грузов в различных аксонах периферических нервов для количественного мониторинга аксонального транспорта в области здоровья и заболеваний.
Периферическая нервная система (ПНС) соединяет центральную нервную систему (ЦНС) со своими дистальными мишенями, позволяя реле эфферентных сигналов осуществлять двигательный контроль и афферентных сигналов для обеспечения сенсорной обратной связи. Используя множество достижений в генетике мышей, ученые разработали различные мышиные модели для исследования многих заболеваний / синдромов, поражающих PNS 1,2,3. Поскольку большинство нейродегенеративных патологий являются многофакторными с автономным и неавтономным вкладом клеток 4,5, распутывание клеточных / нейрон-специфических патологий может дать решающее, новое понимание механизмов заболевания.
С этой целью развитие бактериальной искусственной хромосомы (BAC)-трансгенных мышей6 позволило селективной эндогенной экспрессии флуоресцентных белков в целевых подмножествах нейронов. Например, доступны BAC-трансгенные мыши, которые экспрессируют зеленый флуоресцентный белок (GFP) в холинергических7 или глицинергических нейронах8, или вариант красного флуоресцентного белка (tdTomato) в парвальбумин-положительных нейронах9. Альтернативно, селективная нейронная экспрессия флуоресцентных белков может быть достигнута с помощью технологии Cre-loxP 10. Например, мышиные штаммы, экспрессирующие cre-рекомбиназу в подмножествах нейронов (например, холинацетилтрансфераза (ChAT)-Cre), могут быть выведены с мышами, которые экспрессируют флуоресцентный белок (например, tdTomato или GFP) из конститутивного локуса (например, Gt(ROSA)26Sor) под контролем транскрипционного репрессора, окруженного участками loxP11 (например, генерируя мышей, которые экспрессируют tdTomato только в холинергических нейронах). Действительно, используя рекомбинацию Cre-loxP, были получены трансгенные мыши, которые экспрессируют желтый флуоресцентный белок в аксонах нисходящего кортикоспинального тракта12.
Кроме того, последние достижения в редактировании генов CRISPR/Cas9, такие как ORANGE, позволяют флуоресцентно маркировать несколько эндогенных нейронных белков с экспрессией, достижимой при наноразмерном разрешении13. Кроме того, в сочетании с Cre-экспрессирующими штаммами мыши, ORANGE-CAKE может быть использован для маркировки нескольких эндогенных белков в отдельных нейронах13. Альтернативно, вирусно-опосредованное трассировка нейронов также позволяет маркировать подмножества нейронов и может быть достигнута с помощью целевых комбинаций вирусных серотипов и/или клеточно-специфических промоторов 14,15,16,17.
В дополнение к методам маркировки нейронов мышиные линии также были разработаны для экспрессии репортерных белков, нацеленных на конкретные органеллы, такие как митохондрии, экспрессирующие голубой флуоресцентный белок (Mito.CFP)18 или аутофагосомы, экспрессирующие GFP (LC3.GFP)19. Кроме того, мышиные линии были разработаны для оценки динамики кальция конкретно в нейронах (например, Thy1.GCaMP)20,21. В целом, с развитием таких моделей новые экспериментальные приложения позволяют ученым задавать более точные биологические и патологические вопросы о ЦНС и ПНС.
Основная роль периферических двигательных нервов заключается в передаче электрических сигналов скелетным мышцам, чтобы вызвать движение. Кроме того, и происходящие в более длительных временных масштабах, нейрохимические и физиологические сообщения в виде различных органелл (например, митохондрий, эндолизосом, сигнальных эндосом) пересекают цитоскелетную сеть одно- или двунаправленным образом, чтобы помочь поддерживать нейронный гомеостаз 22,23,24. Нарушения в аксональном транспорте имеют катастрофические последствия для здоровья нейронов и связаны со многими заболеваниями нервного развития и нейродегенеративными заболеваниями25. На молекулярном уровне нарушения аксонального транспорта могут нарушить физиологические события, регулирующие синаптическую передачу сигналов и пластичность, транскрипцию генов и локальную трансляцию по всему аксону26,27. Хотя существует множество инструментов для изучения этих событий в культивируемых клетках / нейронах28,29, оценка динамики аксонального транспорта и аксонально-связанных биологических событий in vivo необходима для подтверждения ключевых идей физиологических и патологических процессов30.
На протяжении многих лет лаборатория Schiavo оптимизировала протоколы, чтобы задавать различные вопросы об аксональном транспорте 31,32,33,34,35,36. Эти эксперименты расширились после открытия того, что флуоресцентно меченый атоксин столбнячного нейротоксина (HCT) усваивается в терминалы аксонов в скелетных мышцах посредством взаимодействия с нидогенами и полизиалоганглиозидами37. После интернализации HCT ретроградно транспортируется в Rab7-положительных, нейротрофинсодержащих сигнальных эндосомах, которые предназначены для клеточных тел двигательных и сенсорных нейронов 38,39,40,41. Параллельно с этим достижения в технологии визуализации позволили в режиме реального времени анализировать пучки периферических нервов и отдельные аксоны у живых, обезболенных мышей30. Первый набег на оценку динамики аксонального транспорта in vivo при патологии выявил предсимптомные нарушения в транспорте сигнальных эндосом и митохондрий в мышиной модели бокового амиотрофического склероза (БАС)35 SOD1G93A. Важно отметить, что эти дефекты вряд ли будут представлять собой вторичные последствия нейродегенерации, учитывая, что потеря двигательных нейронов может произойти при отсутствии возмущений аксонального транспорта в мышиной модели болезни Кеннеди42 и гетерозиготной мутантной модели FUS ALS43. Такие аксональные транспортные дефициты могут быть устранены у мышей с БАС с использованием ингибиторов специфическихкиназ 33 или рецепторов фактора роста34. Кроме того, обработка нейронов специфическим блокатором гистондеацетилазы изменяет митохондриальный транспорт in vivo36. Совсем недавно мы сообщали, что BDNF-зависимая модуляция аксонального транспорта дисрегулируется в различных подтипах двигательных нейронов у мышей ALS44.
Используя постоянно расширяющийся инструментарий для оценки динамики аксонального транспорта28,29, этот видеопротокол описывает несколько приложений, которые позволят получить дальнейшее понимание различных биологических и патологических сценариев. Во-первых, трансгенные мыши, которые избирательно экспрессируют флуоресцентные белки в холинергических нейронах (то есть двигательных нейронах), используются для различения моторных и сенсорных аксонов как in vivo, так и ex vivo. Флуоресцентно меченый HCT затем загружается в сигнальные эндосомы в трех трансгенных линиях для дифференциации динамики аксонального транспорта в различных периферических нейронах. Следующий экспериментальный протокол детализирует мультиплексный флуоресцентный подход для оценки митохондриального транспорта, особенно в двигательных нейронах, путем разведения мышей ChAT.tdTomato с мышами Mito-CFP. Наконец, приведены инструкции о том, как одновременно изображать митохондрии и сигнальные эндосомы в пределах одного аксона in vivo.
В этом протоколе подробно описываются шаги по оценке in vivo аксонального транспорта сигнальных эндосом и митохондрий в интактных аксонах мышиного седалищного нерва. Действительно, предусмотрена экспериментальная установка, которая позволяет пользователям 1) отличать моторные нейроны от сенсорных in vivo, in situ и ex vivo с помощью мышей, экспрессирующих флуоресцентные репортерные белки, селективно экспрессируемые в моторных нейронах; 2) оценить in vivo аксональный транспорт сигнальных эндосом конкретно в аксонах двигательных нейронов с использованием трех различных трансгенных мышей; 3) исследовать in vivo аксональный транспорт митохондрий конкретно в аксонах двигательных нейронов; и 4) одновременно оценивать динамику переноса in vivo сигнальных эндосом и митохондрий в пределах одного аксона. Этот подход имеет огромный потенциал для исследования аксонального транспорта в базальных условиях и может быть использован для оценки патологических возмущений при различных заболеваниях, затрагивающих периферические двигательные и сенсорные нервы.
Используя предыдущие экспериментальные парадигмы в качестве основы31,32, здесь мы получили подробные новые, надежные способы дифференциации аксонального транспорта, происходящего в моторных и сенсорных нейронах с использованием трансгенных репортерных мышей. Используя мышь Mito.CFP, этот подход был дополнительно разработан для оценки митохондриального транспорта in vivo путем избегания инъекций интрасциаазного нерва TMRE36. Это позволяет обойти возможные нейронные повреждения и возмущения в аксональном транспорте, вызванные внутринервной инъекцией зонда. Кроме того, этот протокол позволяет визуализировать аксональный транспорт нескольких органелл в двигательных аксонах, иннервирующих мышцы с различными физиологическими свойствами (например, быстро дергающиеся утомляемые мышцы против медленно дергающихся мышц, устойчивых к усталости). Таким образом, сигнальная эндосома и/или динамика митохондриального аксонального транспорта могут быть оценены в различных подмножествах α-моторных нейронов44. Кроме того, аксональный транспорт этих органелл в патологических условиях также может быть оценен путем скрещивания с мышиными моделями различных нейродегенеративных заболеваний 1,2,3.
Инструментарий аксонального транспорта постоянно расширяетсяна 28,29, и были разработаны протоколы ex vivo для оценки динамики транспорта с использованием культивируемых эксплантов вентрального рога мыши49 или иссеченных нервно-мышечных препаратовмыши 50. Кроме того, разработка протоколов оценки аксонального транспорта в индуцированных человеческих плюрипотентных стволовых клетках (hiPSC), полученных из кортикальных51 нейронов или hiPSC-производных спинальных двигательных нейронов52, позволила исследовать нейроны человека с болезнетворными мутациями. Такие передовые протоколы в ткани мыши и клетках человека могут обеспечить критическое понимание функции нейронов, облегчить новые патомеханистические открытия в моделях нейродегенеративных заболеваний и использоваться для тестирования терапевтических молекул и стратегий.
Для успешного внедрения этих методов необходимо предпринять ряд важнейших шагов, и в разделе протокола были представлены некоторые важные замечания. Основными требованиями для прижизненной визуализации являются инвертированный конфокальный микроскоп с индивидуальной сценической вставкой и оборудование для поддержания анестезии и оптимальной температуры. Действительно, специализированная мобильная анестезиологическая система необходима для 1) индукции анестезии, 2) вскрытия / обработки тканей (то есть обнажения седалищного нерва) и 3) поддержания анестезии во время прижизненной визуализации (как ранее подробно описано в 31,32). Особенно при использовании объективов с более высоким увеличением (например, 40x или 63x), глубина анестезии может повлиять на качество изображения, так как более глубокая анестезия вызывает большие «загазованные» вдохи, которые приводят к частым смещениям фокуса. Такие большие движения, несомненно, повлияют на анализ транспортировки после визуализации (например, отслеживание грузов с использованием фиджийских плагинов TrackMate53 или KymoAnalyzer54), поскольку дыхательные движения производят артефакты в покадровых видео, которые могут сделать их непригодными для автоматического отслеживания или потребовать более трудоемкой оценки. Кроме того, мы также наблюдали артефакты визуализации, вызванные пульсирующими артериями внутри седалищного нерва, которые могут быть решены только путем выбора другой области визуализации. Микроскоп должен быть оснащен камерой окружающей среды, способной поддерживать постоянную температуру тела, так как температура и рН влияют на аксональный транспорт55. Кроме того, следует избегать применения анальгетиков после операции, так как они могут изменить транспортную динамику56. Если экспериментальная конструкция является продольной и требует повторной визуализации (например, 57), протоколы вскрытия должны быть соответствующим образом скорректированы, чтобы быть минимально инвазивными и могут потребовать дополнительного этического/лицензионного одобрения.
Необходимо иметь в виду некоторые экспериментальные соображения . Во-первых, большинство протоколов, подробно описанных в настоящем описании, включают использование трансгенных мышей, которые обладают флуоресцентными репортерными белками в митохондриях или аксонах моторных нейронов. Каждая из этих линий мыши должна быть выведена и изображена как геми-/гетерозигота. Исключениями, однако, являются мышиные линии ChAT.Cre и Rosa26.tdTomato, которые могут отдельно поддерживаться в качестве гомозигот, при этом полученное потомство гемизиготы обеспечивает экспрессию tdTomato в холинергических нейронах после рекомбинации Cre-loxP . При скрещивании трансгенных геми-/гетерозиготных мышей (например, Mito.CFP) с другими трансгенными геми-/гетерозиготными мышами (например, ChAT.eGFP) необходимо тщательно рассмотреть стратегию размножения, так как получение желаемого количества двухмутантного потомства может занять много времени. Более того, при разведении F1 поколения мышей ChAT.Cre и Rosa26.tdTomato (т.е. ChAT.tdTomato) с дополнительными трансгенными штаммами (например, Mito.CFP) следует ожидать еще меньшего количества мышей, несущих желаемые тройные трансгены. Кроме того, необходимо также учитывать потенциальное перекрытие флуорофоров при разведении двухрепортерных мышей с близкими свойствами длины волны (например, Mito-CFP-возбуждение: 435 нм, излучение: 485 нм, выведенное с ChAT.eGFP-возбуждение: 488 нм, излучение: 510 нм), хотя эту проблему можно преодолеть при спектральном размешивании58.
Этот метод имеет некоторые ограничения, которые следует учитывать. В этой работе и наших предыдущих протоколах31,32 мы показали, как несколько генетически закодированных маркеров и различные методы окрашивания могут быть использованы для маркировки и отслеживания различных органелл in vivo. Однако не все зонды подходят для такого экспериментального подхода. Мы оценили инъекции в ТА или камбаловидную мышцу бета-субъединицы холерного токсина (CTB)-488 (0,5-1,5 мкг / мкл ~ 4 ч до визуализации), зонд, обычно используемый для маркировки тел клеток двигательных нейронов в экспериментах с ретроградными индикаторами in vivo 59,60. Однако при инъекции в одиночку или совместной инъекции с HCT-555 маркировка CTB-488 была плохой, несмотря на использование концентраций, аналогичных тем, которые использовались для успешного отслеживания ретроградных двигательных нейронов. Таким образом, мы приходим к выводу, что, несмотря на то, что CTB является отличным маркером in vitro сигнальных эндосом в нейронных культурах61, HCT остается зондом золотого стандарта для идентификации сигнальных эндосом in vivo в аксонах седалищного нерва.
Используя различные маршруты, мы также протестировали зонды, обычно используемые для маркировки лизосом, таких как LysoTracker зеленый DND-26, и маркеры активных лизосомальных гидролаз, таких как BODIPY-FL-пепстатин A для катепсина D62 и Magic Red для катепсина B, но без успеха. Мы попробовали внутримышечную доставку BODIPY-FL-пепстатина А (2,5 мкг в ТА ~ 4 ч до визуализации), а также инъекцию интрашиационного нерва 2 мкл LysoTracker (10 мкМ), BODIPY-FL-пепстатина A (10 мкМ) или Magic Red (1/10) за 30-60 минут до визуализации. Несмотря на эти зонды, выделяющие нерв, мы не смогли найти четко обозначенные органеллы. Зонды накапливались вокруг аксонов, вероятно, удерживаясь шванновскими клетками. Следовательно, неудачная маркировка лизосом может быть вызвана недостаточной доставкой зонда в нейроны, хотя существование более подходящих концентраций нельзя исключать. Учитывая, что маркировка TMRE работает в аналогичных условиях (т.е. инъекции внутрисиатикального нерва), интенсивность маркировки может зависеть от красителя и должна быть проверена для каждого маркера независимо. Однако мы приходим к выводу, что нацеливание лизосом in vivo с помощью этих зондов невозможно при указанных выше концентрациях.
Методы анестезии могут изменять различные физиологические показания (например, функция улитки63 и кортикальная электрофизиология64); однако влияет ли анестезия in vivo на аксональный транспорт в седалищном нерве, в настоящее время неизвестно. Учитывая снижение нервно-мышечной активности при изофлуран-индуцированной анестезии, возможно, что кинетика транспорта отличается по сравнению с бодрствующим состоянием. Тем не менее, единственное исследование in vivo, которое непосредственно исследовало это, показало, что транспорт плотных пузырьков ядра в таламокортикальных проекциях не отличается между анестезированными и бодрствующими мышами65. Кроме того, поскольку различия в переносе между мышами дикого типа и моделью заболевания обнаруживаются под анестезией 35,43, ясно, что воздействие изофлурана не препятствует выявлению возмущений при передаче сигналов эндосом или митохондриальном трафике.
Этот протокол имеет и другие потенциальные применения, которые были описаны ниже. Разведение трансгенных мышей, описанных в этом протоколе (например, Mito.CFP, ChAT.eGFP) с нейродегенеративными моделями заболеваний мышей 1,2,3, позволит проводить исследования подтипов нейронов и/или грузов. Кроме того, недавно разработанные мышиные линии Cre66 также позволят визуализировать флуоресцентные репортерные белки в различных популяциях сенсорных аксонов. Например, мышей Rosa26.tdTomato можно скрестить с нейропептидом Y-рецептор-2-экспрессирующим (Npy2r). Cre mouse для обеспечения флуоресценции tdTomato в миелинизированных ноцицепторахА-волокна 67. Кроме того, временное управление также может быть достигнуто путем использования индуцируемых систем Cre (например, тамоксифена)68. Другое потенциальное применение зависит от наличия трансгенных мышей, экспрессирующих флуоресцентные репортерные белки в шванновских клетках. Действительно, мыши S100-GFP69 и PLP-GFP70 позволяют проводить визуализацию клеток Шванна in vivo и / или in situ и находятся на переднем крае исследований, связанных с миграцией шванновских клеток во время регенерации периферических нервов.
В дополнение к этим применениям и дополнению мыши Mito.CFP является наличие нескольких трансгенных линий мыши, которые экспрессируют флуоресцентные белки в различных органеллах, таких как митохондрии и аутофагосомы. Например, исследование in vivo митохондриального транспорта может быть возможно с помощью мыши mito::mKate271 или фотоконвертируемой мыши mitoDendra57. Кроме того, перенос митофагосом in vivo может быть возможен с использованием pH-чувствительной мыши мито-Кейма72 и мыши73 мито-КК для анализа митофагии. Кроме того, трудности лизосомальной маркировки, с которыми мы столкнулись, могут быть преодолены с помощью мышей, экспрессирующих LAMP1-GFP, с оговоркой, что LAMP1 также присутствует в эндоцитарных органеллах, отличных от лизосом74.
Таким образом, мы предоставили новые способы оценки in vivo аксонального транспорта нескольких органелл в специфических аксонах периферических нервов у различных трансгенных мышей. Одновременная визуализация различных органелл будет особенно важна, учитывая недавние результаты аксональных взаимодействий и совместного оборота органелл, таких как митохондрии и эндосомы75,76. Мы считаем, что представленные методы будут полезны для улучшения понимания базальной физиологии аксонов in vivo и распутывания важных патомеханизмов, приводящих к нейродегенерации периферических нервов.
The authors have nothing to disclose.
Мы хотели бы поблагодарить Роберта М. Браунстоуна (Институт неврологии Queen Square, Университетский колледж Лондона) за то, что он поделился мышами ChAT-eGFP, ChAT.Cre и Rosa26.tdTomato, а также Пьетро Фратта (Институт неврологии Queen Square, Университетский колледж Лондона) за распространение HB9. Мышь GFP. Мы хотели бы поблагодарить Елену Р. Раймс, Шарлотту Дж.. Кремерс и Цюхан Ланг (Институт неврологии Queen Square, Университетский колледж Лондона) за критическое прочтение рукописи. Эта работа была поддержана младшей доклинической стипендией от Ассоциации заболеваний двигательных нейронов (Великобритания) (Tosolini/Oct20/973-799) (APT), наградой Wellcome Trust Senior Investigator Awards (107116/Z/15/Z и 223022/Z/21/Z) (GS), премией Фонда Научно-исследовательского института деменции Великобритании (GS); и премия Совета по медицинским исследованиям за развитие карьеры (MR/S006990/1) (JNS).
0.2 mL PCR tube | |||
70% (v/v) ethanol in distilled water | |||
AlexaFlour555 C2 maleimide | ThermoFisher Scientific | A-20346 | Can also use AlexaFlour-488 or -647 Maleimide |
B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm9(CAG-tdTomato)Hze/J | Jackson Laboratory | 7909 | Rosa26.tdTomato mice |
B6.Cg-Tg(Hlxb9-GFP)1Tmj/J mice | Jackson Laboratory | 5029 | HB9.GFP mice |
B6.Cg-Tg(Thy1-CFP/COX8A)S2Lich/J mice | Jackson Laboratory | 7967 | Mito.CFP mice |
B6;129S6-Chattm2(cre)Lowl/J mice | Jackson Laboratory | 6410 | ChAT.Cre mice |
Computer with microscope control and image acquisition software | Zeiss | Zen | |
Cotton swab | |||
Desktop centrifuge | |||
Dissecting microscope | |||
Eye lubricant | |||
Fine curved forceps | Dumont | ||
Fine straight forceps | Dumont | ||
Glass coverslip (22 x 64 mm, thickness no. 1) | |||
Graduated, glass micropipette with microliter markings and plunger | Drummond Scientific | 5-000-1001-X10 | |
Hair clippers | |||
Hamilton microliter syringe (701 N, volume 10 μL, needle size 26 s G, bevel tip, needle L 51 mm) | Merck | 20779 | |
HcT-441 | N/A | N/A | See Restani et al., 2012 for more details |
Heating pad | |||
Immersion oil for fluorescent imaging at 37 °C | |||
Inverted confocal microscope with environmental chamber | Zeiss | LSM 780 | Most inverted confocals should be adaptable |
Isoflurane | |||
Isoflurane vaporizer/anesthesia machine with induction cham-ber and mask stabilizer | |||
Magic tape | invisible tape | ||
Micropipette puller | |||
Parafilm | Parafilm | ||
Phosphate-buffered saline (PBS): 137 mM NaCl, 10 mM Na2HPO4, 2.7 mM KCl, 1.8 mM KH2PO4–HCl, pH 7.4 | |||
Recombinant human brain-derived neurotrophic factor (BDNF) | Peprotech | 450-02 | BDNF that can be used to co-inject with HcT-555 |
Saline | |||
Scalpel blade | Dumont | ||
Small spring scissors | Dumont | ||
Surgery/operating microscope | |||
Surgical drape | |||
Surgical suture | |||
Surgical tape | |||
Tg(Chat-EGFP) GH293Gsat/Mmucd mice | MMRRC | 000296-UCD | ChAT.eGFP |
Vortex mixer |