使用转基因荧光小鼠,描述了详细的方案,以评估活体动物完整坐骨神经的运动和感觉轴突内信号内体和线粒体的 体内 轴突转运。
轴突转运通过实现各种细胞器和货物的双向运输来维持神经元稳态。轴突运输的中断对单个神经元及其网络具有破坏性后果,并导致过多的神经系统疾病。由于其中许多情况涉及细胞自主和非自主机制,并且通常显示跨神经元亚型的病理学谱,因此准确识别和分析神经元亚群的方法势在必行。
本文详细介绍了评估麻醉小鼠坐骨神经中信号内体和线粒体的 体内 轴突转运方案。提供逐步说明,以1)通过使用在胆碱能运动神经元内选择性表达荧光蛋白的小鼠, 在体内,原位 和 离体 区分运动神经元和感觉神经元;2)单独或同时评估信号内体和线粒体的 体内 轴突转运。这些互补的活体内方法有助于同时对不同周围神经轴突中的不同货物进行成像,以定量监测健康和疾病中的轴突转运。
周围神经系统(PNS)将中枢神经系统(CNS)连接到其远端目标,允许传出信号的中继施加运动控制,传入信号提供感觉反馈。利用小鼠遗传学的大量进展,科学家们开发了不同的小鼠模型来研究折磨PNS1,2,3的许多疾病/综合征。由于大多数神经退行性疾病是多因素的,细胞自主和非自主贡献4,5,解开细胞/神经元特异性病理学可以为疾病机制提供关键的,新颖的见解。
为此,细菌人工染色体(BAC)转基因小鼠6 的发育使得荧光蛋白在神经元的靶向亚群中的选择性内源性表达成为可能。例如,BAC转基因小鼠可用,其在胆碱能7 或甘氨酸能神经元8中表达绿色荧光蛋白(GFP),或在小白蛋白阳性神经元9中表达变异红色荧光蛋白(tdTomato)。或者,荧光蛋白的选择性神经元表达可以通过Cre-loxP 技术10来实现。例如,在神经元亚群(例如,胆碱乙酰转移酶(ChAT)-Cre)中表达Cre-重组酶的小鼠菌株可以与表达荧光蛋白(例如,tdTomato或GFP)的小鼠一起繁殖,这些小鼠来自构成位点(例如,Gt(ROSA)26Sor),在loxP位点11 两侧的转录抑制因子的控制下(例如,产生仅在胆碱能神经元中表达tdTomato的小鼠)。事实上,使用Cre-loxP重组,已经产生了在下降皮质脊髓束12的轴突中表达黄色荧光蛋白的转基因小鼠。
此外,CRISPR / Cas9基因编辑的最新进展,如ORANGE,能够对多种内源性神经元蛋白进行荧光标记,其表达可以在纳米级分辨率13下实现。此外,与表达Cree的小鼠菌株结合使用,ORANGE-CAKE可用于标记单个神经元中的多种内源性蛋白质13。或者,病毒介导的神经元示踪也允许标记神经元亚群,并且可以通过病毒血清型和/或细胞特异性启动子14,15,16,17的靶向组合来实现。
除了神经元标记方法之外,小鼠品系还被设计成表达靶向特定细胞器的报告蛋白,例如表达青色荧光蛋白(Mito.CFP)18 的线粒体或表达GFP(LC3.GFP)19的自噬体。此外,已经设计了小鼠系来评估神经元中的钙动力学(例如, Thy1.GCaMP)20,21。总而言之,随着这些模型的进步,新的实验应用使科学家能够提出有关CNS和PNS的更精确的生物学和病理学问题。
周围运动神经的主要作用是将电信号传递到骨骼肌以引发运动。此外,并且以各种细胞器(例如,线粒体、内溶酶体、信号内体)的形式在较长的时间尺度上发生,神经化学和生理信息以单向或双向方式穿过细胞骨架网络,以帮助维持神经元稳态22、23、24。轴突转运的损伤对神经元健康具有灾难性后果,并且与许多神经发育和神经退行性疾病有关25.在分子水平上,轴突转运的损伤可以破坏调节突触信号传导和可塑性的生理事件,基因转录和整个轴突26,27的局部翻译。虽然有许多工具可以研究培养细胞/神经元中的这些事件28,29, 但需要评估 体内 轴突运输动力学和轴突相关的生物事件来确认对生理和病理过程的关键见解30。
多年来,Schiavo实验室优化了协议,以询问有关轴突运输31,32,33,34,35,36的各种问题。这些实验已经从发现荧光标记的破伤风神经毒素(HCT)的毒性片段通过与nidogens和多鞭毛胶苷脂的相互作用内化到骨骼肌的轴突末端37扩展。一旦内化,HCT逆行运输在Rab7阳性,含神经营养蛋白的信号内体中,这些内体被运往运动和感觉神经元的细胞体38,39,40,41。与此同时,成像技术的进步使得能够实时分析活的麻醉小鼠30中的周围神经束和单个轴突。首次尝试评估病理学中的体内轴突转运动力学,揭示了肌萎缩性侧索硬化症(ALS)35的SOD1G93A小鼠模型中信号内体和线粒体的转运的症状前损伤。重要的是,这些缺陷不太可能仅仅代表神经变性的次要后果,因为发现在肯尼迪病42的小鼠模型和ALS43的杂合突变FUS模型中,运动神经元丢失可以在没有轴突转运扰动的情况下发生。这种轴突转运缺陷可以使用特异性激酶33或生长因子受体34的抑制剂在ALS小鼠中补救。此外,用特定的组蛋白去乙酰化酶阻滞剂治疗神经元会改变体内线粒体转运36。最近,我们报告说,在ALS小鼠44的不同运动神经元亚型中,轴突转运的BDNF依赖性调节失调。
通过使用不断扩展的工具包来评估轴突传递动力学28,29,该视频协议概述了几个应用程序,这些应用程序将允许进一步了解不同的生物学和病理场景。首先,在胆碱能神经元(即运动神经元 )中选择性表达荧光蛋白的转基因小鼠用于 区分体内 和 离体的运动和感觉轴突。然后将荧光标记的HCT加载到三个转基因系的信号内体中,以区分不同外周神经元中的轴突转运动力学。下一个实验方案详细介绍了一种多重荧光方法,该方法通过将ChAT.tdTomato小鼠与水母-CFP小鼠繁殖来评估运动神经元中的线粒体转运。最后,提供了有关如何 在体内同时对同一轴突内的线粒体和信号内体进行成像的说明。
该协议详细说明了在小鼠坐骨神经的完整轴突中评估信号内体和线粒体的 体内 轴突转运的步骤。实际上,提供了一种实验装置,使用户能够通过使用表达在运动神经元中选择性表达的荧光报告蛋白的小鼠, 在体内,原位和 离体 中区分运动神经元和感觉神经元;2)使用三种不同的转基因小鼠在运动神经元轴突中评估信号内体的 体内 轴突转运;3)研究线粒体的 体内 轴突转运,特别是在运动神经元轴突中;4)同时评估同一轴突内信号体和线粒体的 体内 转运动力学。这种方法在研究基础疾病中的轴突转运方面具有巨大的潜力,可用于评估影响周围运动和感觉神经的不同疾病的病理扰动。
使用以前的实验范例作为基础31,32,在这里,我们有详细的新颖,稳健的方法来区分运动中发生的轴突转运与使用转基因报告小鼠的感觉神经元。使用Mito.CFP小鼠,这种方法已被进一步发展,通过避免坐骨神经内注射TMRE36来评估体内线粒体转运。这避免了由神经内注射探针引起的轴突转运中可能的神经损伤和扰动。此外,该协议允许可视化运动轴突中多个细胞器的轴突转运,这些轴突支配具有不同生理特性的肌肉(例如,快速抽搐的疲劳性肌肉与缓慢抽搐的抗疲劳肌肉)。因此,可以在α运动神经元的不同亚群中评估信号内体和/或线粒体轴突转运动力学44。此外,这些细胞器在病理环境中的轴突转运也可以通过与不同神经退行性疾病的小鼠模型杂交来评估1,2,3。
轴突转运工具包不断扩展28,29,并且已经开发 出离体 方案,以使用培养的小鼠腹角外植体49 或切除的小鼠神经肌肉制剂50来评估转运动力学。此外,开发用于评估诱导的人多能干细胞(hiPSC)衍生的皮质51 神经元或hiPSC衍生的脊髓运动神经元52 中的轴突转运的方案,使得能够研究具有致病突变的人类神经元。小鼠组织和人类细胞中的这种尖端方案可以提供对神经元功能的关键见解,促进神经退行性疾病模型中的新病理机制发现,并用于测试治疗分子和策略。
要成功实现这些技术,需要遵循几个关键步骤,协议部分提供了一些重要的说明。活体成像的主要要求是带有定制载物台插入物台的倒置共聚焦显微镜以及保持麻醉和最佳温度的设备。事实上,需要一个专门的移动麻醉系统来1)诱导麻醉,2)解剖/组织处理(即暴露坐骨神经),以及3)在活体成像期间保持麻醉(如先前详述的31,32)。特别是当使用更高的放大倍率物镜(例如,40x或63x)时,麻醉深度会影响图像质量,因为更深的麻醉会引起大的“气”呼吸,导致焦点频繁偏移。这种较大的运动无疑会影响成像后运输分析(例如,使用斐济插件TrackMate53或KymoAnalyzer54跟踪货物),因为呼吸运动在延时视频中产生伪影,使它们不适合自动跟踪或需要更耗时的评估。此外,我们还观察到由坐骨神经内脉动动脉引起的成像伪影,这只能通过选择不同的成像区域来解决。显微镜必须配备能够保持恒定体温的环境室,因为温度和pH值影响轴突转运55。此外,应避免在手术后使用镇痛药,因为它们可以改变运输动力学56。如果实验设计是纵向的,需要重复成像(例如,57),则需要适当调整解剖方案以达到微创,并且可能需要额外的伦理/许可批准。
需要牢记某些 实验注意事项 。首先,本文详述的大多数方案涉及使用在线粒体或运动神经元轴突中具有荧光报告蛋白的转基因小鼠。这些小鼠品系中的每一个都应该被培育和成像为半合子/杂合子。然而,例外的是ChAT.Cre和Rosa26.tdTomato小鼠品系,它们可以单独维持为纯合子,由此产生的半合子后代能够在Cre-loxP 重组后在胆碱能神经元中表达tdTomato。当转基因半合子/杂合子小鼠(例如Mito.CFP)与其他转基因半合子/杂合子小鼠(例如ChAT.eGFP)杂交时,需要仔细考虑育种策略,因为获得所需数量的双突变后代可能非常耗时。此外,当用额外的转基因菌株(例如,水母细胞)繁殖F1代ChAT.Cre和Rosa26.tdtomato小鼠(即ChAT.tdTomato)时,应该期望携带所需三重转基因的小鼠更少。此外,在繁殖具有附近波长特性的两只报告小鼠时,还必须考虑潜在的荧光团重叠(例如,Mito-CFP激发:435nm,发射:485nm,用ChAT.eGFP激发:488nm,发射:510nm)繁殖,尽管有可能通过光谱不混合58来克服这个问题。
此技术有一些需要考虑的局限性。在这项工作和我们之前的实验方案31,32中,我们已经展示了如何使用几种遗传编码的标记和不同的染色方法来标记和跟踪体内不同的细胞器。然而,并非所有探头都适合这种实验方法。我们评估了向TA或比目鱼肌中注射霍乱毒素β亚基(CTB)-488(成像前0.5-1.5μg/ μL〜4小时),该探针常规用于标记体内逆行示踪剂实验中的运动神经元细胞体59,60。然而,当单独注射或与HCT-555共同注射时,CTB-488标记很差,尽管使用的浓度类似于用于成功逆行运动神经元追踪的浓度。因此,我们得出结论,尽管CTB是神经元培养物61中信号内体信号传导的优秀体外标志物,但HCT仍然是在坐骨神经轴突中识别体内信号内体的金标准探针。
使用不同的途径,我们还测试了常规用于标记溶酶体的探针,如LysoTracker绿色DND-26,以及活性溶酶水解酶的标志物,如组织蛋白酶D62 的BODIPY-FL-胃抑素A和组织蛋白酶B的Magic Red,但没有成功。我们尝试肌内注射BODY-FL-肽抑素A(成像前2.5μg进入TA〜4小时),以及在成像前30-60分钟注射2μLLysoTracker(10μM),BODIPY-FL-肽抑素A(10μM)或魔术红(1/10)。尽管这些探针突出了神经,但我们无法找到明确标记的细胞器。探针积聚在轴突周围,可能被施万细胞保留。因此,溶酶体标记不成功可能是由于向神经元的探针递送不足,尽管不能排除存在更合适的浓度。鉴于TMRE标记在类似条件下起作用(即坐骨神经内注射),标记强度可能是染料依赖性的,必须针对每个标记物独立测试。然而,我们得出结论,在上述浓度下,用这些探针 靶向体内 溶酶体是不可行的。
麻醉方法可以改变不同的生理读数(例如,耳蜗功能63 和皮质电生理学64);然而,麻醉是否影响坐骨神经 中的体内 轴突转运目前尚不清楚。鉴于异氟醚诱导的麻醉下神经肌肉活性降低,与清醒状态相比,运输动力学可能不同。然而,唯一直接研究这一点的 体内 研究表明,在丘脑皮质投影中密集的核心囊泡的运输在麻醉小鼠和清醒小鼠65之间没有差异。此外,由于在麻醉35,43下可以检测到野生型和疾病模型小鼠之间的运输区别,因此很明显,异氟醚暴露不会阻止识别信号内体或线粒体运输中的扰动。
该协议还有其他 潜在的应用,如下所述。将本方案中概述的转基因小鼠(例如,Mito.CFP,ChAT.eGFP)与神经退行性疾病小鼠模型1,2,3 的育种将实现神经元亚型和/或货物特异性研究。此外,最近开发的小鼠Cre系66 还允许在不同的感觉轴突群体中可视化荧光报告蛋白。例如,罗莎26.td多马托小鼠可以与神经肽Y受体-2表达(Npy2r)杂交。Cre鼠标使tdTomato荧光在有髓鞘A纤维伤害感受器67中。此外,时间控制也可以通过使用诱导Cre系统(例如,他莫昔芬)68来实现。另一个潜在的应用依赖于在施万细胞中表达荧光报告蛋白的转基因小鼠的可用性。事实上,S100-GFP69 和PLP-GFP70 小鼠能够对施万细胞进行 体内 和/或 原位 成像,并且一直处于周围神经再生期间施旺细胞迁移研究的最前沿。
除了这些应用和补充Mito.CFP小鼠之外,还有几种转基因小鼠品系的可用性,这些小鼠系在不同细胞器(如线粒体和自噬体)中表达荧光蛋白。例如,研究体内线粒体转运可能是可能的有丝分裂::mKate2小鼠71或光可转换有丝分裂小鼠57。此外,使用pH敏感的丝裂凯马小鼠72和丝线肌QC小鼠73进行有丝分裂自噬分析,可以进行体内有丝分裂噬体转运。此外,通过使用表达LAMP1-GFP的小鼠可以克服我们遇到的溶酶体标记困难,但需要注意的是,LAMP1也存在于与溶酶体74不同的内吞细胞器中。
总之,我们提供了新的方法来评估来自不同转基因小鼠的特定周围神经轴突中几种细胞器的 体内 轴突转运。鉴于最近发现的轴突相互作用和细胞器(如线粒体和内体75,76)的共同运输,不同细胞器的同步成像将特别重要。我们认为,所提出的方法将有助于提高对 体内 轴突基础生理学的理解,并解开驱动周围神经变性的重要病理机制。
The authors have nothing to disclose.
我们要感谢罗伯特·布朗斯通(伦敦大学学院皇后广场神经病学研究所)分享ChAT-eGFP,ChAT.Cre和Rosa26.tdTomato小鼠,以及彼得罗·弗拉塔(伦敦大学学院皇后广场神经病学研究所)分享HB9。通用防空导弹。我们要感谢Elena R. Rhymes,夏洛特J.P.克雷默斯和邱汉朗(伦敦大学学院皇后广场神经病学研究所)对手稿的批判性阅读。这项工作得到了运动神经元疾病协会(英国)(Tosolini/Oct20/973-799)(APT)的初级非临床奖学金,威康信托基金高级研究员奖(107116/Z/15/Z和223022/Z/21/Z)(GS)的支持,英国痴呆症研究所基金会奖(GS);和医学研究委员会职业发展奖(MR / S006990 / 1)(JNS)。
0.2 mL PCR tube | |||
70% (v/v) ethanol in distilled water | |||
AlexaFlour555 C2 maleimide | ThermoFisher Scientific | A-20346 | Can also use AlexaFlour-488 or -647 Maleimide |
B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm9(CAG-tdTomato)Hze/J | Jackson Laboratory | 7909 | Rosa26.tdTomato mice |
B6.Cg-Tg(Hlxb9-GFP)1Tmj/J mice | Jackson Laboratory | 5029 | HB9.GFP mice |
B6.Cg-Tg(Thy1-CFP/COX8A)S2Lich/J mice | Jackson Laboratory | 7967 | Mito.CFP mice |
B6;129S6-Chattm2(cre)Lowl/J mice | Jackson Laboratory | 6410 | ChAT.Cre mice |
Computer with microscope control and image acquisition software | Zeiss | Zen | |
Cotton swab | |||
Desktop centrifuge | |||
Dissecting microscope | |||
Eye lubricant | |||
Fine curved forceps | Dumont | ||
Fine straight forceps | Dumont | ||
Glass coverslip (22 x 64 mm, thickness no. 1) | |||
Graduated, glass micropipette with microliter markings and plunger | Drummond Scientific | 5-000-1001-X10 | |
Hair clippers | |||
Hamilton microliter syringe (701 N, volume 10 μL, needle size 26 s G, bevel tip, needle L 51 mm) | Merck | 20779 | |
HcT-441 | N/A | N/A | See Restani et al., 2012 for more details |
Heating pad | |||
Immersion oil for fluorescent imaging at 37 °C | |||
Inverted confocal microscope with environmental chamber | Zeiss | LSM 780 | Most inverted confocals should be adaptable |
Isoflurane | |||
Isoflurane vaporizer/anesthesia machine with induction cham-ber and mask stabilizer | |||
Magic tape | invisible tape | ||
Micropipette puller | |||
Parafilm | Parafilm | ||
Phosphate-buffered saline (PBS): 137 mM NaCl, 10 mM Na2HPO4, 2.7 mM KCl, 1.8 mM KH2PO4–HCl, pH 7.4 | |||
Recombinant human brain-derived neurotrophic factor (BDNF) | Peprotech | 450-02 | BDNF that can be used to co-inject with HcT-555 |
Saline | |||
Scalpel blade | Dumont | ||
Small spring scissors | Dumont | ||
Surgery/operating microscope | |||
Surgical drape | |||
Surgical suture | |||
Surgical tape | |||
Tg(Chat-EGFP) GH293Gsat/Mmucd mice | MMRRC | 000296-UCD | ChAT.eGFP |
Vortex mixer |