Une méthode pratique de perfusion par gravité pour l’analyse histologique du système nerveux central de la souris est présentée. La détection immunofluorescente de la α-synucléine phosphorylée est démontrée dans un modèle murin de la maladie de Parkinson. Ce travail décrit également de manière exhaustive les étapes de perfusion transcardique, de dissection, de congélation /intégration des tissus et de sectionnement congelé.
L’analyse histologique d’échantillons de cerveau et de moelle épinière isolés de souris est une pratique courante pour l’évaluation de la pathologie dans ce système modèle. Pour maintenir la morphologie de ces tissus délicats, il est courant d’administrer un fixateur chimique tel que le paraformaldéhyde via la canulation du cœur chez les animaux anesthésiés (perfusion transcardique). La perfusion transcardique du cœur de la souris repose traditionnellement sur l’utilisation de pompes péristaltiques ou de pression d’air pour fournir à la fois les solutions salines et fixatrices nécessaires à ce processus. En tant qu’alternative facilement accessible à ces méthodes, ce travail démontre l’utilisation d’une méthode de livraison de perfusat alimentée par gravité qui utilise des matériaux disponibles dans la plupart des quincailleries.
Pour valider cette nouvelle méthode de perfusion, ce travail démontre toutes les étapes ultérieures nécessaires à la détection sensible de la α-synucléine phosphorylée dans le cerveau et la moelle épinière. Ces étapes comprennent la dissection des tissus fixes du cerveau et de la moelle épinière, la congélation / incorporation rapide et la cryosection des tissus et la coloration immunofluorescente. Comme cette méthode entraîne l’administration du fixateur par tout le corps, elle peut également être utilisée pour préparer d’autres tissus non neuronaux à l’analyse histologique.
La caractérisation histologique de la pathologie dans le système nerveux central (SNC) de la souris est une technique de routine utilisée dans les études sur la neurodégénérescence. Comme les tissus neuronaux se dégradent rapidement après la mort, il est courant de délivrer un fixateur chimique tel que le paraformaldéhyde aux tissus du SNC pour préserver leur morphologie 1,2. La fixation chimique peut être réalisée soit par perfusion du corps entier avec une solution fixatrice, soit par l’isolement des tissus et leur immersion dans une solution fixatrice (appelée « fixation par goutte »). La perfusion est la méthode préférée d’administration fixative, car la fixation de goutte peut ne pas permettre une pénétration rapide de la solution fixative dans les structures profondes du SNC 3,4,5. De plus, comme il est difficile d’enlever la moelle épinière non fixée de la colonne vertébrale, l’administration de la solution fixatrice par perfusion permet la préservation in situ de la moelle épinière microscopique et de l’anatomie globale et raidit le tissu pour minimiser les dommages lors du retrait.
La livraison des solutions tampons et fixatrices nécessaires à la fixation est généralement effectuée à l’aide de pompes ou de pression d’air disponibles dans le commerce. L’administration par gravité de perfusat peut servir d’alternative à la distribution par pompe pour les raisons suivantes : (1) La distribution de pression de pompe ou d’air peut, dans certains cas, obliger un utilisateur à maintenir manuellement la pression dans le système tout au long de la perfusion. La livraison par gravité du perfusat peut être maintenue sans intervention de l’utilisateur. (2) Un appareil de perfusat livré par gravité peut être construit à faible coût pour l’utilisateur en obtenant des matériaux disponibles auprès de fournisseurs scientifiques standard. Ce travail décrit comment construire un dispositif de perfusion par gravité simple à l’aide de bouteilles de lavage et de tubes en vinyle. En utilisant un modèle murin de la maladie de Parkinson, ce travail démontre l’efficacité de ce système dans la perfusion des tissus du cerveau et de la moelle épinière avant leur isolement pour une section congelée. Ce travail décrit de manière exhaustive toutes les étapes, techniques et matériaux nécessaires pour disséquer le tissu fixe hors de l’animal, congeler / intégrer et cryosectionner rapidement le tissu et détecter la présence de α-synucléine phosphorylée dans le cerveau et la moelle épinière par microscopie à immunofluorescence indirecte.
Ce travail décrit les étapes critiques pour effectuer la perfusion transcardique. Lors de la construction de l’appareil de perfusion (section 1 du protocole), il est important d’utiliser un tube suffisamment flexible pour être complètement obstrué par un hémostat. Certains tubes rigides peuvent ne pas être suffisamment obstrués par un hémostat et peuvent encore permettre au PFA de s’infiltrer dans la conduite principale lors de la perfusion initiale du PBS. Lors de la préparation de la solution de PFA à 4%, il est important de s’assurer que le pH est physiologique (7.4). Comme la préparation de la solution de PFA implique de la chauffer à 65 °C, la solution doit être refroidie à 25 °C avant de mesurer le pH, car il s’agit de la température à laquelle le pH est étalonné sur le compteur.
Lors de l’incision initiale dans l’abdomen, il faut veiller à éviter la lacération des organes abdominaux (section 2 du protocole). Lors de la dissection supérieure vers le diaphragme, il est important d’éviter la lacération du foie car il est courant que le foie adhère à la paroi abdominale antérieure. Pour surmonter cela, le foie est soigneusement et carrément disséqué loin de la paroi antérieure avant de poursuivre une incision vers le diaphragme. Lorsque vous entrez dans la cavité thoracique par le diaphragme, il est important d’éviter la lacération du cœur, des grands vaisseaux et des poumons. Pour éviter cela, la pointe des ciseaux est maintenue superficiellement et à un angle aigu avec la cage thoracique.
La dissection initiale pour exposer le cœur prend environ 2 minutes à partir de l’incision initiale. On s’attend à ce que pendant ce temps, un peu d’air soit entré dans la pointe de l’aiguille du papillon. L’introduction de cet air dans la circulation de la souris donnera une perfusion de mauvaise qualité. Par conséquent, il est essentiel que la ligne principale soit ouverte et que le PBS soit rincé à travers l’aiguille immédiatement avant la canulation du cœur pour éliminer les bulles d’air. Idéalement, le cœur est canulé tandis qu’un petit filet PBS traverse la pointe de l’aiguille pour assurer l’absence totale d’air lors de la perforation du BT.
Lorsque l’aiguille pénètre dans le LV, elle ne doit pas aller assez profondément pour introduire la pointe de l’aiguille dans le ventricule droit (RV). Le placement de l’aiguille dans le VR ou au-delà de la valve mitrale entraînera un « gonflage » immédiat des poumons lorsque la perfusion est commencée. Ceci n’est pas souhaitable et l’aiguille doit être légèrement retirée pour assurer le placement du LV. Si l’aiguille est placée correctement, les poumons resteront plats tout au long de la perfusion. Lorsque la perfusion est initiée, on observe parfois qu’un liquide clair émerge de la bouche ouverte de l’animal. Cela est généralement dû à une pression de perfusion trop élevée ou à un mauvais placement de l’aiguille dans le cœur. Les auteurs spéculent que des pressions de perfusion élevées entraînent une extravasation du perfusate du lit capillaire artériolaire et un écoulement rétrograde du PBS via l’arbre bronchique dans l’œsophage et la cavité buccale.
La pression de perfusion doit être abaissée soit en diminuant le niveau de PBS dans le flacon PBS, soit en abaissant la hauteur du flacon PBS. Alternativement, si l’aiguille est placée trop profondément dans le ventricule gauche, elle peut traverser la valve mitrale et délivrer du perfusate à l’oreillette gauche. Cela peut entraîner un écoulement rétrograde dans les veines pulmonaires et une extravasation du perfusate dans les artérioles, comme décrit ci-dessus. Une clairance complète du sang du système circulatoire avec pbS est particulièrement importante pour éviter la réticulation des composants sanguins induite par un fixateur entraînant une occlusion des vaisseaux lors de la perfusion fixative ultérieure. La clairance est efficacement évaluée par un changement de couleur du foie et du flux de PBS à partir d’une incision dans la base ventrale de la queue. La clairance sanguine est généralement complète par 3 min de perfusion avec PBS; cependant, si des signes visuels de clairance se produisent à des moments plus courts, le fixateur est introduit plus tôt que 3 min. Des temps de dégagement plus longs ne sont pas recommandés car une perfusion fixative retardée conduit à des artefacts dans la structure fine duSNC 1.
Lorsque le PFA est administré, il est important de surveiller le niveau de solution de PFA dans le flacon de PFA. Remplissez la bouteille de PFA si le niveau de PFA tombe à moins de 4 cm au-dessus de la bouche de la bouteille de PFA. Une fois la perfusion terminée, l’appareil de perfusion doit être soigneusement rincé à l’eau distillée. Ceci est important car le PFA résiduel dans la ligne principale contaminera la perfusion initiale de PBS avec du PFA et entraînera une perfusion de mauvaise qualité. Enfin, les aiguilles papillon 25 G sont généralement recommandées pour les souris adultes de taille moyenne comprises entre 20 et 30 g. Cependant, les souris plus grandes ou plus petites peuvent nécessiter des aiguilles de jauge légèrement plus grandes ou plus petites en plus du réglage des bouteilles fixatrices pour fournir des débits optimaux.
Pour la dissection du SNC et l’incorporation d’OCT (section 3 du protocole), il est fréquent que les tissus de la moelle épinière ne coulent pas complètement dans le saccharose à 30%. Ces tissus sont donc laissés dans du saccharose pendant 2 jours puis incrustés dans l’OCT, qu’ils coulent ou non. Lors de la congélation des tissus dans l’OCT, il est possible que certains tissus se fissurent lorsqu’ils sont placés dans du 2-méthylbutane refroidi. Ceci est plus fréquent avec le cerveau et se produit généralement lorsque trop d’OCT est placé sur le tissu. Pour éviter cela, placez seulement assez d’OCT pour couvrir les surfaces tissulaires avant la congélation immédiate. Dans certains protocoles, la fissuration est moins fréquente malgré une immersion complète dans l’OCT. Cela est généralement dû à une méthode de congélation plus lente, par exemple lors de l’utilisation de 2-méthylbutane refroidi à la glace carbonique ou en plaçant directement le cryomoulage sur un bloc de glace carbonique. Le 2-méthylbutane refroidi à l’azote liquide est préféré dans ce travail car le taux de congélation est beaucoup plus rapide et peut mieux préserver la morphologie des tissus que les méthodes de congélation plus lentes.
Lors de la cryosection du tissu (section 4 du protocole), il est important d’éviter les cycles multiples de gel-dégel. Par conséquent, il est optimal de couper toutes les sections d’un seul bloc OCT pour obtenir une région spécifique du cerveau à analyser au lieu de décongeler et de recongeler des zones sélectionnées. Si cela n’est pas viable, après avoir obtenu quelques sections, les utilisateurs peuvent recongeler et stocker les blocs OCT dans le congélateur de -80 ° C 1 à 2 fois de plus pour une utilisation future.
Les principaux avantages de cette méthode par rapport à la pompe plus traditionnelle ou à l’administration de perfusat à pression d’air sont les suivants: (1) faible coût et accessibilité de l’appareil de perfusion. (2) Les utilisateurs n’ont pas besoin de maintenir manuellement la pression dans l’appareil de perfusion tout au long de la perfusion. (3) Pression de perfusion plus faible et plus constante que d’autres alternatives de perfusion à faible coût, telles que l’administration de seringues. En utilisant l’équation de Bernoulli, il est calculé que l’appareil de perfusion alimenté par gravité construit ici maintiendra une pression de perfusion d’environ 73 mm Hg lorsque les bouteilles de perfusat sont placées à 1 m d’altitude par rapport à l’aiguille. Étant donné que celle-ci est significativement inférieure à la pression artérielle systolique de ces animaux, cette pression de perfusion est probablement suffisamment basse pour éviter une rupture vasculaire12.
Les auteurs ont jusqu’à présent utilisé avec succès ce système de perfusion pour détecter la présence de α-synucléine phosphorylée dans un modèle murin de la maladie de Parkinson. Pendant ce temps, aucune limitation significative de cette méthode de perfusion n’a été rencontrée qui n’est pas présente avec une méthode d’administration par perfusion par pompe. La principale limite de cette technique est la nature chronophage de la perfusion par rapport à la fixation des gouttes. Cette technique est préférable à la fixation des gouttes car la perfusion entraîne une pénétration plus profonde du fixateur dans les structures du SNC. Une deuxième limitation de cette technique est qu’elle nécessite une certaine habileté chirurgicale pour fonctionner, car le cœur doit être canulé rapidement après l’entrée dans la cavité thoracique. Cependant, avec l’expérience, les utilisateurs formés peuvent systématiquement canuler le cœur dans les 1 minutes suivant l’incision initiale dans l’abdomen.
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs remercient Xiaowen Wang, Liam Coyne et Jason Grullon pour leur aide dans l’élaboration de ce protocole. Ce travail a été soutenu par les subventions des NIH AG061204 et AG063499.
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BD General Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles, 18 G | Fisher Scientific | 14-826-5D | |
BD General Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles, 22 G | Fisher Scientific | 14-826B | |
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