Een handige zwaartekracht-gevoede perfusiemethode voor histologische analyse van het centrale zenuwstelsel van de muis wordt gepresenteerd. Immunofluorescentie detectie van gefosforyleerd α-synucleïne wordt aangetoond in een muismodel van de ziekte van Parkinson. Dit werk beschrijft ook uitgebreid de transcardiale perfusie, dissectie, weefselbevriezing / inbedding en bevroren sectiestappen.
De histologische analyse van hersen- en ruggenmergmonsters geïsoleerd uit muizen is gebruikelijk voor de beoordeling van pathologie in dit modelsysteem. Om de morfologie van deze delicate weefsels te behouden, is het routine om een chemisch fixatief zoals paraformaldehyde toe te dienen via cannulatie van het hart bij verdoofde dieren (transcardiële perfusie). Transcardiale perfusie van het muizenhart is van oudsher afhankelijk van het gebruik van peristaltische pompen of luchtdruk om zowel de zoutoplossing als fixatieve oplossingen te leveren die nodig zijn voor dit proces. Als een gemakkelijk toegankelijk alternatief voor deze methoden, demonstreert dit werk het gebruik van een zwaartekracht-gevoede methode van perfusaatlevering die materialen gebruikt die beschikbaar zijn in de meeste bouwmarkten.
Om deze nieuwe perfusiemethode te valideren, toont dit werk alle volgende stappen die nodig zijn voor de gevoelige detectie van gefosforyleerd α-synucleïne in zowel de hersenen als het ruggenmerg. Inbegrepen in deze stappen zijn de dissectie van de vaste hersen- en ruggenmergweefsels, snelle bevriezing / inbedding en cryosectie van de weefsels en immunofluorescente kleuring. Aangezien deze methode resulteert in de levering van het fixatief door het hele lichaam, kan het ook worden gebruikt om andere niet-neuronale weefsels voor te bereiden op histologische analyse.
Histologische karakterisering van pathologie in het centrale zenuwstelsel van de muis (CZS) is een routinetechniek die wordt gebruikt in studies van neurodegeneratie. Omdat neuronale weefsels na de dood snel afbreken, is het gebruikelijk om een chemisch fixatief zoals paraformaldehyde aan de CZS-weefsels af te leveren om hun morfologie te behouden 1,2. Chemische fixatie kan worden uitgevoerd door perfusie van het hele lichaam met een fixatieve oplossing of door de isolatie van weefsels en hun onderdompeling in een fixatieve oplossing (genaamd “druppelfixatie”). Perfusie is de voorkeursmethode voor fixatieve toediening, omdat druppelfixatie mogelijk geen snelle penetratie van de fixatieve oplossing in diepe CZS-structurenmogelijk maakt 3,4,5. Bovendien, omdat het moeilijk is om het niet-gefixeerde ruggenmerg uit de wervelkolom te verwijderen, zorgt de toediening van de fixatieve oplossing via perfusie voor het in situ behoud van het microscopische en grove anatomie van het ruggenmerg en verstijft het weefsel om schade tijdens verwijdering te minimaliseren.
Levering van de buffer- en fixatieve oplossingen die nodig zijn voor fixatie wordt gewoonlijk uitgevoerd met behulp van in de handel verkrijgbare pompen of luchtdruk. Zwaartekrachtafgifte van perfusaat kan om de volgende redenen dienen als alternatief voor pompafgifte: (1) Pomp- of luchtdrukafgifte kan in sommige gevallen vereisen dat een gebruiker handmatig de druk in het systeem handhaaft gedurende de perfusie. De zwaartekrachtafgifte van perfusaat kan worden gehandhaafd zonder tussenkomst van de gebruiker. (2) Een door de zwaartekracht geleverd perfusaatapparaat kan tegen lage kosten voor de gebruiker worden gebouwd door materialen te verkrijgen die beschikbaar zijn bij standaard wetenschappelijke verkopers. Dit werk beschrijft hoe u een eenvoudig zwaartekrachtperfusieapparaat kunt bouwen met behulp van wasflessen en vinylbuizen. Met behulp van een muismodel van de ziekte van Parkinson toont dit werk de werkzaamheid van dit systeem aan bij het doordrenken van de hersenen en het ruggenmergweefsel voorafgaand aan hun isolatie voor bevroren secties. Dit werk beschrijft uitgebreid alle stappen, technieken en materialen die nodig zijn om het vaste weefsel uit het dier te ontleden, het weefsel snel te bevriezen / in te bedden en te cryosectie en de aanwezigheid van gefosforyleerd α-synucleïne in zowel de hersenen als het ruggenmerg te detecteren via indirecte immunofluorescentiemicroscopie.
Dit werk beschrijft de kritieke stappen voor het uitvoeren van transcardiale perfusie. Bij het bouwen van het perfusieapparaat (protocol paragraaf 1) is het belangrijk om slangen te gebruiken die flexibel genoeg zijn om volledig te worden afgesloten door een hemostat. Sommige stijve buizen worden mogelijk niet voldoende afgesloten door een hemostat en kunnen PFA nog steeds in de hoofdlijn laten lekken tijdens de initiële PBS-perfusie. Bij het bereiden van de 4% PFA-oplossing is het belangrijk om ervoor te zorgen dat de pH fysiologisch is (7,4). Aangezien de bereiding van de PFA-oplossing gepaard gaat met verhitting tot 65 °C, moet de oplossing vóór het meten van de pH worden afgekoeld tot 25 °C, aangezien dit de temperatuur is waarbij de pH op de meter wordt gekalibreerd.
Bij het maken van de eerste incisie in de buik moet ervoor worden gezorgd dat scheuren van de buikorganen worden voorkomen (protocol sectie 2). Bij het superieur ontleden naar het middenrif, is het belangrijk om scheuring van de lever te voorkomen, omdat het gebruikelijk is dat de lever zich hecht aan de voorste buikwand. Om dit te ondervangen, wordt de lever zorgvuldig en botweg weggesneden van de voorste wand voordat een incisie naar het diafragma wordt voortgezet. Bij het betreden van de thoracale holte via het diafragma, is het belangrijk om scheuren van het hart, grote bloedvaten en de long te voorkomen. Om dit te voorkomen, wordt de schaarpunt oppervlakkig en onder een scherpe hoek met de ribbenkast gehouden.
De initiële dissectie om het hart bloot te leggen duurt ongeveer 2 minuten vanaf de eerste incisie. Verwacht wordt dat gedurende deze tijd wat lucht in de punt van de vlindernaald is gekomen. De introductie van deze lucht in de circulatie van de muis zal perfusie van slechte kwaliteit opleveren. Daarom is het van cruciaal belang dat de hoofdlijn wordt geopend en PBS onmiddellijk voorafgaand aan de cannulatie van het hart door de naald wordt gespoeld om luchtbellen te verwijderen. Idealiter wordt het hart gecannuleerd terwijl een klein PBS-straaltje door de naaldpunt stroomt om de volledige afwezigheid van lucht bij het doorboren van de LV te garanderen.
Wanneer de naald in de LV komt, mag deze niet zo diep gaan dat de naaldpunt in de rechter ventrikel (RV) wordt gebracht. Plaatsing van de naald in de RV of voorbij de mitralisklep zal resulteren in onmiddellijke “inflatie” van de longen wanneer perfusie wordt gestart. Dit is ongewenst en de naald moet enigszins worden teruggetrokken om LV-plaatsing te garanderen. Als de naald goed wordt geplaatst, blijven de longen plat tijdens de perfusie. Wanneer perfusie wordt geïnitieerd, wordt soms waargenomen dat er een heldere vloeistof uit de open mond van het dier komt. Dit komt meestal door een te hoge perfusiedruk of door misplaatsing van de naald in het hart. De auteurs speculeren dat verhoogde perfusiedrukken resulteren in extravasatie van het perfusaat uit het arteriolar capillaire bed en retrograde stroom van PBS via de bronchiale boom in de slokdarm en mondholte.
De perfusiedruk moet worden verlaagd door het PBS-niveau in de PBS-fles te verlagen of door de hoogte van de PBS-fles te verlagen. Als alternatief, als de naald te diep in de linker ventrikel wordt geplaatst, kan deze door de mitralisklep reizen en perfusaat afgeven aan het linkeratrium. Dit kan resulteren in retrograde stroom door de longaders en extravasatie van perfusaat in de arteriolen, zoals hierboven beschreven. Grondige klaring van bloed uit de bloedsomloop met PBS is vooral belangrijk om fixatief geïnduceerde cross-linking van bloedbestanddelen te voorkomen, wat resulteert in vaatocclusie bij daaropvolgende fixatieve perfusie. Klaring wordt effectief beoordeeld door een kleurverandering van de lever en PBS-stroom van een incisie in de ventrale staartbasis. De bloedklaring is over het algemeen voltooid na 3 minuten perfusie met PBS; als visuele tekenen van klaring echter op kortere tijdstippen optreden, wordt fixatief eerder dan 3 minuten geïntroduceerd. Langere klaringstijden worden niet aanbevolen omdat vertraagde fixatieve perfusie leidt tot artefacten in de fijne structuur van het CZS1.
Wanneer PFA wordt toegediend, is het belangrijk om het niveau van PFA-oplossing in de PFA-fles te controleren. Vul de PFA-fles als het PFA-niveau daalt tot minder dan 4 cm boven de mond van de PFA-fles. Nadat de perfusie is voltooid, moet het perfusieapparaat grondig worden gespoeld met gedestilleerd water. Dit is belangrijk omdat resterende PFA in de hoofdlijn de initiële PBS-perfusie met PFA zal besmetten en zal resulteren in perfusie van slechte kwaliteit. Ten slotte worden vlindernaalden van 25 G over het algemeen aanbevolen voor volwassen muizen van gemiddelde grootte in het bereik van 20-30 g. Grotere of kleinere muizen kunnen echter iets grotere of kleinere naalden nodig hebben naast de aanpassing van de fixatieve flessen om optimale stroomsnelheden te bieden.
Voor CNS-dissectie en OCT-inbedding (protocolsectie 3) is het gebruikelijk dat ruggenmergweefsels niet volledig in 30% sucrose zinken. Deze weefsels worden daarom 2 dagen in sucrose gelaten en vervolgens ingebed in OCT, ongeacht of ze zinken of niet. Bij het invriezen van weefsels in OCT is het mogelijk dat bepaalde weefsels kunnen barsten wanneer ze in gekoeld 2-methylbutaan worden geplaatst. Dit komt vaker voor bij de hersenen en treedt meestal op wanneer er te veel OCT op het weefsel wordt geplaatst. Om dit te voorkomen, plaatst u slechts voldoende OCT om de weefseloppervlakken te bedekken voordat u onmiddellijk invriest. In sommige protocollen komt kraken minder vaak voor, ondanks volledige onderdompeling in OCT. Dit komt meestal door een langzamere vriesmethode, zoals bij het gebruik van droogijsgekoeld 2-methylbutaan of het direct plaatsen van de cryomold op een blok droogijs. Vloeibaar-stikstofgekoeld 2-methylbutaan heeft de voorkeur in dit werk omdat de snelheid van invriezen aanzienlijk sneller is en de weefselmorfologie beter kan behouden dan langzamere vriesmethoden.
Bij cryosectie van het weefsel (protocol sectie 4) is het belangrijk om meerdere vries-dooicycli te vermijden. Daarom is het optimaal om alle secties uit een enkel OCT-blok te snijden om een specifiek hersengebied voor analyse te verkrijgen in plaats van geselecteerde gebieden te ontdooien en opnieuw te bevriezen. Als dit niet haalbaar is, kunnen gebruikers na het verkrijgen van een paar secties de OCT-blokken opnieuw invriezen en nog 1-2 keer in de -80 ° C diepvriezer opslaan voor toekomstig gebruik.
De belangrijkste voordelen van deze methode ten opzichte van meer traditionele pomp- of luchtdruktoevoer van perfusaat zijn als volgt: (1) lage kosten en toegankelijkheid van het perfusieapparaat. (2) Gebruikers hoeven de druk in het perfusieapparaat tijdens de perfusie niet handmatig te handhaven. (3) Lagere en consistentere perfusiedruk dan andere goedkope alternatieven voor perfusie, zoals via spuitafgifte. Met behulp van de vergelijking van Bernoulli wordt berekend dat het hier geconstrueerde perfusieapparaat met zwaartekracht gevoede perfusie een perfusiedruk van ongeveer 73 mm Hg zal handhaven wanneer de perfusaatflessen op 1 m hoogte ten opzichte van de naald worden geplaatst. Aangezien dit aanzienlijk lager is dan de systolische bloeddruk van deze dieren, is deze perfusiedruk waarschijnlijk voldoende laag om vasculaire breuk te voorkomen12.
De auteurs hebben dit perfusiesysteem tot nu toe met succes gebruikt om de aanwezigheid van gefosforyleerd α-synucleïne in een muismodel van de ziekte van Parkinson te detecteren. Gedurende deze tijd zijn er geen significante beperkingen met deze perfusiemethode aangetroffen die niet aanwezig zijn bij een pompperfusieafgiftemethode. De belangrijkste beperking van deze techniek is het tijdrovende karakter van perfusie versus druppelfixatie. Deze techniek heeft de voorkeur boven het laten vallen van fixatie, omdat perfusie resulteert in de diepere penetratie van fixatief op de CZS-structuren. Een tweede beperking van deze techniek is dat het enige chirurgische vaardigheid vereist om uit te voeren, omdat het hart snel moet worden gecannuleerd na binnenkomst in de thoracale holte. Met ervaring kunnen getrainde gebruikers het hart echter routinematig binnen 1 minuut na de eerste incisie in de buik uleren.
The authors have nothing to disclose.
De auteurs bedanken Xiaowen Wang, Liam Coyne en Jason Grullon voor hun hulp bij het ontwikkelen van dit protocol. Dit werk werd ondersteund door de NIH-subsidies AG061204 en AG063499.
2-Methylbutane (Certified ACS), Fisher Chemical | Fisher Scientific | 03551-4 | |
Andwin Scientific Tissue-Tek O.C.T Compound | Fisher Scientific | NC1029572 | |
Artman Instruments 4.5" Straight Castroveijo Spring Action Scissors | Amazon | B0752XHK2X | "fine scissors" |
BD General Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles, 18 G | Fisher Scientific | 14-826-5D | |
BD General Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles, 22 G | Fisher Scientific | 14-826B | |
Corning PES Syringe Filters | Fisher Scientific | 09-754-29 | |
Cytiva HyClone Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x | Fisher Scientific | SH30258 | |
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
Fisher BioReagents Bovine Serum Albumin (BSA) Protease-free Powder | Fisher Scientific | BP9703100 | |
Fisherbrand Curved Medium Point General Purpose Forceps | Fisher Scientific | 16-100-110 | "curved fenestrated forceps" |
Fisherbrand Curved Very Fine Precision Tip Forceps | Fisher Scientific | 16-100-123 | "curved fine forceps" |
Fisherbrand Disposable Graduated Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 13-711-9AM | |
Fisherbrand High Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps | Fisher Scientific | 12-000-122 | "straight fine forceps" |
Fisherbrand Micro Spatulas with Rounded Ends | Fisher Scientific | 21-401-5 | |
Fisherbrand Porcelain Buchner Funnels with Fixed Perforated Plates | Fisher Scientific | FB966J | |
Fisherbrand Premium Cover Glass, 24 x 50 | Fisher Scientific | 12-548-5M | |
Fisherbrand Premium Tissue Forceps 1X2 Teeth 5 in. German Steel | Fisher Scientific | 13-820-074 | "skin forceps" |
Fisherbrand Reusable Heavy-Wall Filter Flasks | Fisher Scientific | FB3002000 | |
Fisherbrand Standard Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 08-951-20 | "dissecting scissors" |
Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use | Fisher Scientific | 14-955-464 | |
Fisherbrand Straight Locking Hemostats | Fisher Scientific | 16-100-115 | |
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
Fisherbrand Vinyl Tubing and Connector Kits, 1/4 in. | Fisher Scientific | 14-174-1C | |
Fisherbrand Wet-Strengthened Qualitative Filter Paper Circles | Fisher Scientific | 09-790-12F | |
Fisherbrand Y Connector with 1/4 in. ID – Polypropylene – QC | Fisher Scientific | 01-000-686 | |
Garvey Economy Single Edge Cutter Blade | Amazon | B001GXFAEQ | |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight 488 | ThermoFisher Scientific | 35552 | |
Ideal Clamp Stant High-Pressure Clamps | Fisher Scientific | 14-198-5A | "hose clamps" |
IMEB, Inc Sakura Accu-Edge Low Profile Microtome Blades, Dispoisable | Fisher Scientific | NC9822467 | |
Kawasumi 25 Gauge Standard Winged Blood Collection Set | Fisher Scientific | 22-010-137 | "butterfly needle" |
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply | Fisher Scientific | 06-666 | |
Molecular Probes ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI | Fisher Scientific | P36962 | |
Nalgene Narrow-Mouth Right-to-Know LDPE Wash Bottles | ThermoFisher Scientific | 2425-0506 | "buffer bottles" |
PAP pen | abcam | ab2601 | |
Paraformaldehyde Granular | Electron Microscopy Systems | 19210 | |
Pyrex Glass Drying Dishes, 34.9 x 24.9 x 6 cm | Fisher Scientific | 15-242D | |
Recombinant Anti-Alpha-synuclein (phospho S129) antibody [EP1536Y] | abcam | ab51253 | |
Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465-2.5kg | |
Stainless Steel Drinking Cup 18-oz | amazon | B0039PPO9U | |
Sucrose for Molecular Biology CAS: 57-50-1 | Us Biological | S8010 | |
Triton X-100 | Us Biological | T8655 | |
Vetone Fluriso Isoflurane USP | MWI Animal Health | 502017 |