Méthodes spectrophotométriques pour l’étude du métabolisme du glycogène eucaryote

Le glycogène est largement distribué dans la nature, le composé se trouvant dans les bactéries, de nombreux protistes, champignons et animaux. Dans les micro-organismes, le glycogène est important pour la survie des cellules lorsque les nutriments sont limitatifs et, chez les organismes supérieurs tels que les mammifères, la synthèse et la dégradation du glycogène servent à tamponner les niveaux de glucose sanguin ^1,2,3. L’étude du métabolisme du glycogène est donc importante pour des domaines aussi divers que la microbiologie et la physiologie des mammifères. Comprendre le métabolisme du glycogène nécessite d’étudier les enzymes clés de la synthèse du glycogène (glycogène synthase et enzyme ramifiée) et de la dégradation du glycogène (glycogène phosphorylase et enzyme débranchante). Les dosages de référence des activités enzymatiques de glycogène synthase, de phosphorylase, de ramification et de débranchement utilisent des isotopes radioactifs. Par exemple, la glycogène synthase est généralement mesurée dans un essai radiochimique arrêté en suivant l’incorporation du glucose de l’UDP-[14 C]glucose (dans le cas des enzymes animales et fongiques) ou de l’ADP-[¹⁴C]glucose (dans le cas des enzymes bactériennes) dans le glycogène ^4,5. De même, la glycogène phosphorylase est mesurée dans le sens de la synthèse du glycogène, suite à l’incorporation du glucose de [¹⁴C]glucose-1-phosphate dans le glycogène⁶. L’enzyme ramifiée est dosée en mesurant la capacité de cette enzyme à stimuler l’incorporation du [14 C]glucose du glucose-1-phosphate dans les chaînes liées α1,4 par la glycogène phosphorylase⁷, et l’activité enzymatique débranchante est déterminée en suivant la capacité de l’enzyme à incorporer [¹⁴C]glucose dans le glycogène⁸ . Bien que très sensibles, permettant leur utilisation dans des extraits cellulaires bruts à faible activité enzymatique, les substrats radioactifs sont coûteux et soumis aux exigences réglementaires liées à l’utilisation de radio-isotopes. Ces obstacles placent l’utilisation de certains tests hors de portée de nombreux travailleurs. Cependant, au cours de nombreuses années, une variété impressionnante d’approches spectrophotométriques pour la mesure de ces enzymes ont été décrites. En général, ces approches reposent en fin de compte sur la mesure de la production ou de la consommation de NADH / NADPH, ou la génération de complexes colorés entre le glycogène et l’iode. Ainsi, ils sont simples et peuvent être réalisés à l’aide de spectrophotomètres simples équipés uniquement de lampes flash au tungstène ou au xénon.

Les dosages spectrophotométriques de la glycogène synthase reposent sur la mesure du diphosphate nucléosidique libéré par le donneur de nucléotides de sucre lorsque le glucose est ajouté à la chaîne de glycogène ^9,10 en croissance. La procédure de mesure de l’activité de la glycogène synthase décrite à la section 1 du protocole, ci-dessous, est une modification de celle décrite par Wayllace et ^coll.11, et le schéma de couplage est illustré ci-dessous :

(Glucose) _n + UPD-glucose → (Glucose)_n+1 + UDP

UDP + ATP → ADP + UTP

ADP + phosphoénolpyruvate → pyruvate + ATP

Pyruvate + NADH + H+ → Lactate + ^NAD+

La glycogène synthase ajoute du glucose de l’UDP-glucose au glycogène. L’UDP généré dans ce processus est converti en UTP par nucléoside diphosphate kinase (NDP kinase), dans une réaction qui génère de l’ADP. L’ADP, à son tour, sert ensuite de substrat pour la pyruvate kinase, qui phosphoryle l’ADP en utilisant le phosphoénolpyruvate comme donneur de phosphate. Le pyruvate résultant est converti en lactate par l’enzyme lactate déshydrogénase dans une réaction qui consomme du NADH. Le test peut donc être effectué de manière continue, en surveillant la diminution de l’absorbance à 340 nm lorsque le NADH est consommé. Il est facilement adapté pour une utilisation avec des enzymes qui nécessitent du glucose ADP comme donneur de glucose. Ici, les étapes de couplage sont plus simples puisque l’ADP libéré par l’action de la glycogène synthase est directement agité par la pyruvate kinase.

Il existe une variété de tests spectrophotométriques disponibles pour la détermination de l’activité de la glycogène phosphorylase. Dans la version classique, l’enzyme est poussée vers l’arrière, dans le sens de la synthèse du glycogène, comme indiqué ci-dessous:

(Glucose) _n + Glucose-1-phosphate → (Glucose)_n+1 + P_i

A intervalles temporels, les aliquotes du mélange réactionnel sont éliminées et la quantité de phosphate libérée est quantifiée^12,13. Dans nos mains, ce test a été d’une utilité limitée en raison de la présence de phosphate libre facilement mesurable dans de nombreuses préparations commerciales de glucose-1-phosphate, combinée aux concentrations élevées de glucose-1-phosphate nécessaires à l’action de la phosphorylase. Au lieu de cela, nous avons régulièrement utilisé un test alternatif qui mesure le glucose-1-phosphate libéré lorsque le glycogène est dégradé par la phosphorylase¹³. Un schéma de réaction couplée, illustré ci-dessous, est utilisé.

(Glucose) n + P_i → (Glucose)_n-1 + Glucose-1-phosphate

Glucose-1-phosphate → Glucose-6-phosphate

Glucose-6-phosphate + NADP+ → 6-phosphogluconolactone + NADPH + H⁺

Le glucose-1-phosphate est converti en glucose-6-phosphate par la phosphoglucomutase, et le glucose-6-phosphate est ensuite oxydé en 6-phosphogluconolactone, avec la réduction concomitante du NADP⁺ en NADPH. La procédure détaillée à la section 2 du protocole, ci-dessous, est dérivée des méthodes décrites par Mendicino et al.14 et Schreiber & Bowling¹⁵. Le test peut être facilement effectué de manière continue, avec l’augmentation de l’absorbance à 340 nm au fil du temps, permettant la détermination de la vitesse de réaction.

La détermination spectrophotométrique de l’activité enzymatique débranchante repose sur la mesure du glucose libéré par l’action de l’enzyme sur la phosphorylase limite la dextrine¹⁶. Ce composé est fabriqué en traitant le glycogène de manière exhaustive avec de la glycogène phosphorylase. Étant donné que l’action de la glycogène phosphorylase arrête 4 résidus de glucose d’un point de branche α1,6, la dextrine limite contient du glycogène, dont les chaînes externes ont été raccourcies à ~4 résidus de glucose. La préparation de la dextrine limite de phosphorylase est décrite ici, en utilisant une procédure dérivée de celles développées par Taylor et al.17 et Makino & Omichi ¹⁸.

Le débranchement est un processus en deux étapes. L’activité de la 4-α-glucanotransférase de l’enzyme débranchante bifonctionnelle transfère d’abord trois résidus de glucose du point de branche à l’extrémité non réductrice d’une chaîne de glucose proche liée α1,4. Le seul résidu de glucose lié à l’α1,6 restant au point de branche est ensuite hydrolysé par l’activité α1,6-glucosidase¹⁹. Le test est généralement effectué de manière arrêtée, le glucose libéré après un temps donné (ou une série de fois) étant mesuré dans un dosage enzymatique couplé comme indiqué ci-dessous:

(Glucose) n → (glucose)_n-1 + glucose

Glucose + ATP → Glucose-6-phosphate + ADP

Glucose-6-phosphate + NADP+ → 6-phosphogluconolactone + NADPH + H⁺

La détermination du NADPH produit donne une mesure de la production de glucose. La procédure décrite à la section 3 du protocole, ci-dessous, est basée sur celle décrite par Nelson et ^al.16. Comme les autres méthodes qui reposent sur la consommation ou la génération de NADH / NADPH, le test est assez sensible. Cependant, la présence d’amylases ou d’autres glucosidases, qui peuvent également libérer le glucose libre de la phosphorylase limite la dextrine, provoquera des interférences importantes (voir Discussion).

La détermination colorimétrique de l’activité enzymatique ramifiée repose sur le fait que les chaînes de glucose liées à l’α1,4 adoptent des structures hélicoïdales qui se lient à l’iode, formant des complexes colorés²⁰. La couleur du complexe formé dépend de la longueur des chaînes liées α1,4. Ainsi, l’amylose, qui consiste en de longues chaînes largement non ramifiées de glucose lié à α1,4, forme un complexe bleu profond avec de l’iode. En revanche, les glycogènes, dont les chaînes externes sont généralement de l’ordre de 6 à 8 résidus de glucose de long, forment des complexes rouge-orangé. Si une solution d’amylose est incubée avec une enzyme ramifiée, l’introduction de branches dans l’amylose entraîne la génération de chaînes de glucose plus courtes liées à α1,4. Ainsi, le maximum d’absorption des complexes amylose/iode se déplace vers des longueurs d’onde plus courtes. La procédure discutée ici est dérivée de celle détaillée par Boyer & Preiss²¹ et l’activité enzymatique ramifiée est quantifiée comme une réduction de l’absorption du complexe amylose / iode à 660 nm au fil du temps.

Comme il ressort clairement de la discussion ci-dessus, le fait que les couleurs des complexes formés entre les chaînes iodée et α1,4-glucose varient avec la longueur de la chaîne signifie que les spectres d’absorbance des complexes glycogène/iode devraient varier avec le degré de ramification du glycogène. C’est en effet le cas, et les glycogènes moins ramifiés / glycogènes avec des chaînes externes plus longues absorbent la lumière à une longueur d’onde plus longue que les glycogènes qui sont plus ramifiés / ont des chaînes externes plus courtes. La réaction de coloration à l’iode peut donc être utilisée pour obtenir des données qualitatives rapides sur le degré de ramification du glycogène²². La couleur brun orangé se forme lorsque les complexes de glycogène avec de l’iode ne sont pas particulièrement intenses. Cependant, le développement de la couleur peut être amélioré par l’inclusion d’une solution saturée de chlorure de calcium²². Cela multiplie par 10 la sensibilité de la méthode et permet une analyse facile des quantités de microgrammes de glycogène. Le dosage pour la détermination de la ramification décrit à la section 4 du protocole, ci-dessous, est adapté d’une procédure développée par Krisman²². Elle est réalisée simplement en combinant l’échantillon de glycogène avec une solution d’iode et de chlorure de calcium dans une cuvette et en collectant le spectre d’absorption de 330 nm à 800 nm. L’absorbance maximale se déplace vers des longueurs d’onde plus longues à mesure que le degré de ramification diminue.

Collectivement, les méthodes décrites ici fournissent des moyens simples et fiables d’évaluer les activités des enzymes clés du métabolisme du glycogène et d’obtenir des données qualitatives sur l’étendue de la ramification du glycogène.