Spectrofotometrische methoden voor de studie van eukaryote glycogeenmetabolisme

Glycogeen is wijd verspreid in de natuur, waarbij de verbinding wordt aangetroffen in bacteriën, vele protisten, schimmels en dieren. In micro-organismen is glycogeen belangrijk voor de overleving van cellen wanneer voedingsstoffen beperkend zijn en in hogere organismen zoals zoogdieren, de synthese en afbraak van glycogeen dienen om de bloedsuikerspiegel^te bufferen ^1,2,3. De studie van het glycogeenmetabolisme is daarom van belang voor zulke uiteenlopende gebieden als microbiologie en zoogdierfysiologie. Het begrijpen van glycogeenmetabolisme vereist het bestuderen van de belangrijkste enzymen van glycogeensynthese (glycogeensynthase en het vertakkende enzym) en glycogeenafbraak (glycogeenfosforylase en debranching enzym). De gouden standaard assays van glycogeensynthase, fosforylase, vertakking en debranching enzymactiviteiten maken gebruik van radioactieve isotopen. Glycogeensynthase wordt bijvoorbeeld over het algemeen gemeten in een gestopte radiochemische test door de opname van glucose uit UDP-[¹⁴C]glucose (in het geval van dierlijke en schimmelenzymen) of ADP-[¹⁴C]glucose (in het geval van bacteriële enzymen) in glycogeen ^4,5 te volgen. Evenzo wordt glycogeenfosforylase gemeten in de richting van glycogeensynthese, na de opname van glucose uit [¹⁴C] glucose-1-fosfaat in glycogeen⁶. Het vertakkende enzym wordt getest door het vermogen van dit enzym te meten om de opname van [¹⁴C]glucose uit glucose-1-fosfaat in α1,4-gekoppelde ketens te stimuleren door glycogeenfosforylase⁷, en de debranching enzymactiviteit wordt bepaald door het volgen van het vermogen van het enzym om [¹⁴C]glucose op te nemen in glycogeen⁸ . Hoewel zeer gevoelig, waardoor hun gebruik in ruwe celextracten met lage niveaus van enzymactiviteit mogelijk is, zijn de radioactieve substraten duur en onderworpen aan de wettelijke vereisten die gepaard gaan met het gebruik van radio-isotopen. Deze barrières plaatsen het gebruik van bepaalde testen buiten het bereik van veel werknemers. In de loop van vele jaren is echter een indrukwekkende verscheidenheid aan spectrofotometrische benaderingen voor het meten van deze enzymen beschreven. Over het algemeen zijn deze benaderingen uiteindelijk afhankelijk van het meten van de productie of consumptie van NADH / NADPH, of het genereren van gekleurde complexen tussen glycogeen en jodium. Ze zijn dus eenvoudig en kunnen worden uitgevoerd met behulp van eenvoudige spectrofotometers die zijn uitgerust met alleen wolfraam- of xenonflitslampen.

Spectrofotometrische testen van glycogeensynthase zijn gebaseerd op het meten van het nucleosidedifosfaat dat vrijkomt uit de suikernucleotidedonor als glucose wordt toegevoegd aan de groeiende glycogeenketen ^9,10. De procedure voor het meten van glycogeensynthase-activiteit beschreven in sectie 1 van het protocol, hieronder, is een wijziging van die beschreven door Wayllace et ^al.11, en het koppelingsschema wordt hieronder weergegeven:

(Glucose) _n + UPD-glucose → (Glucose)_n+1 + UDP

UDP + ATP → ADP + UTP

ADP + fosfoenolpyruvaat → pyruvaat + ATP

Pyruvaat + NADH + H⁺ → Lactaat + NAD⁺

Glycogeensynthase voegt glucose uit UDP-glucose toe aan glycogeen. De UDP die in dit proces wordt gegenereerd, wordt omgezet in UTP door nucleosidedifosfaatkinase (NDP-kinase), in een reactie die ADP genereert. De ADP dient dan op zijn beurt als substraat voor pyruvaatkinase, dat de ADP fosforyleert met behulp van fosfoenolpyruvaat als fosfaatdonor. Het resulterende pyruvaat wordt door het enzym lactaatdehydrogenase omgezet in lactaat in een reactie die NADH verbruikt. De test kan daarom op een continue manier worden uitgevoerd, waarbij de afname van de absorptie bij 340 nm wordt gevolgd als NADH wordt geconsumeerd. Het is gemakkelijk aangepast voor gebruik met enzymen die ADP-glucose als glucosedonor nodig hebben. Hier zijn de koppelingsstappen eenvoudiger omdat de ADP die vrijkomt door de werking van glycogeensynthase direct wordt beïnvloed door pyruvaatkinase.

Er zijn verschillende spectrofotometrische testen beschikbaar voor de bepaling van glycogeenfosforylase-activiteit. In de klassieke versie wordt het enzym naar achteren gedreven, in de richting van glycogeensynthese, zoals hieronder weergegeven:

(Glucose) _n + Glucose-1-fosfaat → (Glucose)_n+1 + P_i

Met getimede tussenpozen worden aliquots van het reactiemengsel verwijderd en wordt de hoeveelheid vrijgekomen fosfaat gekwantificeerd^12,13. In onze handen is deze test van beperkt nut geweest vanwege de aanwezigheid van gemakkelijk meetbaar vrij fosfaat in veel commerciële preparaten van glucose-1-fosfaat, gecombineerd met de hoge concentraties glucose-1-fosfaat die nodig zijn voor fosforylasewerking. In plaats daarvan hebben we routinematig een alternatieve test gebruikt die het glucose-1-fosfaat meet dat vrijkomt als glycogeen wordt afgebroken door fosforylase¹³. Er wordt gebruik gemaakt van een gekoppeld reactieschema, dat hieronder wordt geïllustreerd.

(Glucose) _n + P_i → (Glucose)_n-1 + Glucose-1-fosfaat

Glucose-1-fosfaat → Glucose-6-fosfaat

Glucose-6-fosfaat + NADP⁺ → 6-fosfogluconolacton + NADPH + H⁺

Het glucose-1-fosfaat wordt omgezet in glucose-6-fosfaat door fosfoglucomutase en het glucose-6-fosfaat wordt vervolgens geoxideerd tot 6-fosfogluconolacton, met de gelijktijdige reductie van NADP ⁺ tot NADPH. De procedure die in paragraaf 2 van het protocol hieronder wordt beschreven, is afgeleid van methoden beschreven door Mendicino et ^al.14 en Schreiber & Bowling¹⁵. De test kan gemakkelijk op een continue manier worden uitgevoerd, met de toename van de absorptie bij 340 nm in de loop van de tijd, waardoor de reactiesnelheid kan worden bepaald.

Spectrofotometrische bepaling van de debranching enzymactiviteit is afhankelijk van de meting van de glucose die vrijkomt door de werking van het enzym op fosforylaselimiet dextrine¹⁶. Deze verbinding wordt gemaakt door glycogeen uitputtend te behandelen met glycogeenfosforylase. Omdat de werking van glycogeenfosforylase 4 glucoseresiduen weg van een α1,6-takkenpunt stopt, bevat de limietdextrine glycogeen, waarvan de buitenste ketens zijn verkort tot ~ 4 glucoseresiduen. De bereiding van fosforylaselimiet dextrine wordt hier beschreven, met behulp van een procedure die is afgeleid van die ontwikkeld door Taylor et ^al.17 en Makino & Omichi¹⁸.

Debranching is een proces in twee stappen. De 4-α-glucanotransferase-activiteit van het bifunctionele debranching-enzym brengt eerst drie glucoseresiduen over van het aftakkingspunt naar het niet-reducerende uiteinde van een nabijgelegen α1,4-gekoppelde glucoseketen. Het enkele, α1,6-gebonden glucoseresidu dat op het vertakkingspunt achterblijft, wordt vervolgens gehydrolyseerd door de α1,6-glucosidase-activiteit¹⁹. De test wordt meestal op een gestopte manier uitgevoerd, waarbij de glucose die na een bepaalde tijd (of reeks van tijden) vrijkomt, wordt gemeten in een gekoppelde enzymtest zoals hieronder weergegeven:

(Glucose) _n → (Glucose)_n-1 + Glucose

Glucose + ATP → Glucose-6-fosfaat + ADP

Glucose-6-fosfaat + NADP⁺ → 6-fosfogluconolacton + NADPH + H⁺

De bepaling van de geproduceerde NADPH geeft een maat voor de glucoseproductie. De procedure beschreven in sectie 3 van het protocol, hieronder, is gebaseerd op een procedure beschreven door Nelson et ^al.16. Net als de andere methoden die afhankelijk zijn van de consumptie of generatie van NADH / NADPH, is de test vrij gevoelig. De aanwezigheid van amylasen of andere glucosidasen, die ook vrije glucose uit fosforylaselimietdextrine kunnen vrijmaken, zal echter aanzienlijke interferentie veroorzaken (zie Discussie).

De colorimetrische bepaling van vertakkende enzymactiviteit is gebaseerd op het feit dat α1,4-gekoppelde glucoseketens spiraalvormige structuren aannemen die binden aan jodium en gekleurde complexen vormen²⁰. De kleur van het gevormde complex hangt af van de lengte van de α1,4-gekoppelde ketens. Zo vormt amylose, dat bestaat uit lange, grotendeels onvertakte ketens van α1,4-gebonden glucose, een diepblauw complex met jodium. Glycogenen daarentegen, waarvan de buitenste ketens over het algemeen in de orde van grootte van slechts 6 tot 8 glucoseresiduen lang zijn, vormen oranjerode complexen. Als een oplossing van amylose wordt geïncubeerd met vertakkend enzym, resulteert de introductie van takken in het amylose in de generatie van kortere α1,4-gekoppelde glucoseketens. Zo verschuift het absorptiemaximum van de amylose/jodiumcomplexen naar kortere golflengten. De hier besproken procedure is afgeleid van die beschreven door Boyer &Preiss²¹ en vertakkende enzymactiviteit wordt gekwantificeerd als een vermindering van de absorptie van het amylose / jodiumcomplex bij 660 nm in de loop van de tijd.

Zoals duidelijk zou moeten zijn uit de bovenstaande discussie, betekent het feit dat de kleuren van de complexen gevormd tussen jodium- en α1,4-glucoseketens variëren met de ketenlengte dat de absorptiespectra van glycogeen / jodiumcomplexen moeten variëren met de mate van glycogeenvertakking. Dit is inderdaad het geval, en minder vertakte glycogenen/glycogenen met langere buitenste ketens absorberen licht op een langere golflengte dan glycogenen die meer vertakt zijn /kortere buitenste ketens hebben. De jodiumkleuringsreactie kan daarom worden gebruikt om snelle, kwalitatieve gegevens te verkrijgen over de mate van glycogeenvertakking²². De oranjebruine kleur vormt zich wanneer glycogeencomplexen met jodium niet bijzonder intens zijn. De kleurontwikkeling kan echter worden verbeterd door de toevoeging van verzadigde calciumchlorideoplossing²². Dit verhoogt de gevoeligheid van de methode ongeveer 10-voudig en maakt een kant-en-klare analyse van microgramhoeveelheden glycogeen mogelijk. De in paragraaf 4 van het protocol beschreven test voor de bepaling van vertakkingen is gebaseerd op een procedure ontwikkeld door Krisman²². Het wordt eenvoudig uitgevoerd door het glycogeenmonster te combineren met jodiumoplossing en calciumchloride in een cuvette en het absorptiespectrum van 330 nm tot 800 nm te verzamelen. Het absorptiemaximum verschuift naar langere golflengten naarmate de mate van vertakking afneemt.

Gezamenlijk bieden de hier beschreven methoden eenvoudige, betrouwbare middelen om de activiteiten van de belangrijkste enzymen van het glycogeenmetabolisme te beoordelen en om kwalitatieve gegevens te verkrijgen over de mate van glycogeenvertakking.