Bu nöral hücre ayrışma protokolü, düşük miktarda başlangıç malzemesine sahip numuneler için tasarlanmıştır ve isteğe bağlı sabitleme ve boyama adımlarıyla aşağı akış analizi için oldukça uygun bir tek hücreli süspansiyon sağlar.
Bu nöral ayrışma protokolü (ticari bir yetişkin beyin ayrışma kitine eşlik eden protokolün bir uyarlaması), akış sitometrisi veya tek hücreli dizileme gibi ayrıntılı aşağı akış analizine hazırlık olarak doku işlemeyi optimize eder. Nöral ayrışma, mekanik ayrışma (filtreler, doğrama teknikleri veya pipet tritürasyonu gibi), enzimatik sindirim veya bunların bir kombinasyonu yoluyla gerçekleştirilebilir. Nöronal hücrelerin hassas doğası, tek hücreli analiz için gerekli olan minimum hücresel enkaz ile son derece canlı, gerçek tek hücreli süspansiyonu elde etme çabalarını zorlaştırabilir. Veriler, otomatik mekanik ayrışma ve enzimatik sindirimin bu kombinasyonunun, yukarıda belirtilen zorlukların üstesinden gelerek, sürekli olarak oldukça uygulanabilir (>% 90) tek hücreli bir süspansiyon sağladığını göstermektedir. Adımlardan birkaçı manuel el becerisi gerektirse de, bu adımlar numune kullanımını ve potansiyel hücre kaybını azaltır. Bu makale, aşağı akış analizine hazırlık olarak küçük miktarlarda sinir dokusunu başarılı bir şekilde ayrıştırmak için diğer laboratuvarları donatmak için sürecin her adımını detaylandırmaktadır.
Hipokampus ilk olarak 1500’lüyıllarda bir Bolognese anatomisti olan Giulio Cesare Aranzio tarafından tanımlanmıştır. Bu yeni keşfedilen yapıyı adlandırırken, Aranzio muhtemelen Hipokampus1 cinsinin denizatına olan esrarengiz benzerliğinden ilham aldı. Hipokampus stres tepkilerinde rol oynar, ancak öğrenme ve hafızadaki rolü ile yaygın olarak bilinir. Daha spesifik olarak, hipokampus, bildirimsel ve uzamsal belleğin kodlanmasından ve alınmasından sorumludur1.
Hipokampus veya uygun hipokampus, CA1 (cornu ammonis), CA2 ve CA3 alt alanları1’e ayrılmıştır. Sinir sisteminin geri kalanıyla karşılaştırıldığında, hipokampus, plastisitesi ve devam eden nörogenezpotansiyeli de dahil olmak üzere birçok benzersiz tanımlayıcı özelliğe sahiptir 2. Nörogenez, nöral kök hücrelerin çoğalması ve farklılaşması sürecidir, bunu takiben önceden var olan nöronal ağa entegrasyonları izler. Nörogenez, dentat girusun subgranüler bölgesi ve lateral ventriküllerin (ve koku alma ampullerinin) subventriküler bölgesi ile sınırlıdır3. Nörogenez embriyogenezde bol miktarda bulunurken, yaşam boyu süren bir süreçtir 3,4. Bu nedenle, bu tartışma hipokampustaki yetişkin nörogenezine odaklanacaktır.
Subventriküler ve subgranüler bölgeler, ependimal ve vasküler hücrelerin yanı sıra nöral kök hücrelerin olgunlaşmamış ve olgun soylarını içeren nörojenik nişlerdir5. Mikroglia, nörogenezi düzenlemek için bağışıklık hücreleri olarak bu nişlere katkıda bulunur6. Nöral progenitör hücreler, nöral kök hücrelerin kök hücre dışı soylarıdır7. Subventriküler bölgede üç tip nöral progenitör bulunur: radyal glia benzeri tip B hücreleri, C tipi transitif yükseltici progenitörler ve tip A nöroblastları 3,8. Subventriküler bölgedeki yavaş bölünen tip B nöral progenitör hücreler, hızla bölünen tip C hücrelerine farklılaşabilir8. Daha sonra, C tipi hücreler A tipi hücrelere8 olarak farklılaşır. Bu nöroblastlar, internöronlara veya oligodendrositlere farklılaşmadan önce rostral göç akışından koku alma ampulüne göç eder9. Bu koku alma ampulü internöronları, koku alma kısa süreli hafızanın ve ilişkisel öğrenmenin anahtarıdır, oysa oligodendrositler korpus kallozum9’un miyelinli aksonlarını oluşturur. Erişkin nörogenezin çoğunluğu, radyal tip 1 ve radyal olmayan tip 2 nöral progenitörlerin bulunduğu dentat girusun subgranüler bölgesinde meydana gelir3. Çoğu nöral progenitör hücre, dentat granül nöronları ve astrositler haline gelmeye mahkumdur10. Boşluk kavşaklarıyla birbirine bağlanan astrositler, plastisiteyi, sinaptik aktiviteyi ve nöronal uyarılabilirliği modüle etmek için ağlar oluşturur5. Dentat girusun birincil uyarıcı nöronu olarak, granül hücreler entorinal korteksten CA3 bölgesi11’e girdi sağlar.
Nöral kök hücre popülasyonları immünomanyetik veya immünofloresan izolasyon stratejileri kullanılarak izole edilebilir12,13. Nöral dokunun ayrışması özellikle zordur; Bunu yapma çabaları genellikle zayıf hücre canlılığına sahip numunelerle sonuçlanır ve / veya aşağı akış analizi için gerekli tek hücreli süspansiyonu üretemez. Nöral ayrışma, mekanik ayrışma (filtreler, doğrama teknikleri veya pipet tritürasyonu gibi), enzimatik sindirim veya tekniklerin bir kombinasyonu yoluyla gerçekleştirilebilir14,15. Nöral ayrışma yöntemlerini değerlendiren bir çalışmada, pipet tritürasyonu ile manuel mekanik ayrışmanın canlılığı ve kalitesi ile pipet tritürasyonu ve sindiriminin çeşitli enzimlerle kombinasyonları karşılaştırılmıştır15. Kalite, hazırlanan süspansiyondaki hücre kümelerinin ve DNA veya hücre altı kalıntıların miktarına göre derecelendirildi15. Tek başına manuel mekanik ayrışmaya maruz kalan glial tümörlerin süspansiyonları, dispazlı tedavilerden veya DNaz, kollajenaz ve hyaluronidaz15’in bir kombinasyonundan önemli ölçüde daha düşük hücre canlılığına sahipti. Volovitz ve ark., farklı yöntemler arasındaki canlılık ve kalitedeki çeşitliliği kabul etmiş ve yetersiz ayrışmanın aşağı akış analizinin doğruluğunu azaltabileceğini vurgulamıştır15.
Ayrı bir çalışmada, yazarlar kültürlü nöronal hücrelerin ayrışmasının 60’tan fazla farklı yöntemini ve kombinasyonunu karşılaştırdılar14. Bu yöntemler, pipet tritürasyonu ile manuel mekanik ayrışmanın sekiz farklı varyasyonunu, üç farklı aralıkta beş ayrı enzimle inkübasyonun karşılaştırılmasını ve enzimatik sindirim veya iki enzimin kombinasyonu ile çeşitli mekanik ayrışma kombinasyonlarını içeriyordu14. Mekanik yöntemlerin hiçbiri tek hücreli bir süspansiyon14 vermedi. Tek enzim tedavilerinden dördü, enzimatik tedavilerin on kombinasyonu ve enzimatik sindirim ile mekanik ayrışma kombinasyonlarının dördü tek hücreli bir süspansiyon14 verdi. TrypLE ile enzimatik sindirim ve ardından Tripsin-EDTA en etkili şekilde ayrışmış örnekler14. Bu arada, TrypLE ve / veya Trypsin-EDTA ile muamele edilen örnekler jelatinimsi kümeler oluşturma eğilimindeydi14. Bu çalışma kültürlenmiş hücreler üzerinde yapılırken, pipet tritürasyonu veya enzimatik sindirimin tek başına eksikliklerine değinmektedir.
Manuel ve otomatik mekanik ayrışmanın yan yana karşılaştırmaları eksiktir. Bununla birlikte, bir grup, ticari papain veya tripsin enzimatik ayrışma kitleri16 ile birlikte tüm fare beyinlerinin manuel ve yarı otomatik mekanik ayrışmasını karşılaştırmak için akış sitometrisini çalıştırdı. Ayrışıcı ile işleme daha tutarlı bir şekilde canlı hücreler verdi16. Ayrışmayı takiben, yazarlar ayrıca Prominin-1 hücrelerini, nöronal öncü hücreleri ve mikroglia16’yı izole ettiler. Üç izole hücre popülasyonundan ikisi için, izole hücrelerin saflığı, örnekler ayrışıcı ile işlendiğinde, manuel olarak16’ya kıyasla biraz daha yüksekti. Reiß ve ark., pipetleme tekniğinde kişiden kişiye değişkenliğin, doku ayrışmasında canlı hücre popülasyonu veriminin tekrarlanabilirliğini engellediğini belirtmiştir16. Yazarlar, otomatik mekanik ayrışmanın numune işlemeyi standartlaştırdığı sonucuna varmışlardır16.
Bu makalede özetlenen ayrışma yöntemi, ticari bir yetişkin beyin ayrışma kiti17’ye eşlik eden çözeltiler kullanılarak, tam otomatik mekanik ayrışma ve enzimatik sindirimin bir kombinasyonudur. Standart protokollerden farklı olarak, bu optimize edilmiş protokol numune manipülasyonunu azaltır, son derece uygulanabilir tek hücreli bir süspansiyon sağlar ve minimum miktarda başlangıç dokusunun işlenmesi için tasarlanmıştır.
Bu nöral ayrışma protokolündeki birkaç adım, yeterli teknik ve el becerisi gerektirir – perfüzyon, süpernatant aspirasyon ve miyelin çıkarılması. Perfüzyon süreci boyunca, iç organlar sağlam kalmalıdır (diyaframı çıkarmak ve kalbi kırpmak dışında); bu, kelebek iğnesi ile kalbin üst odalarından kaçınmayı içerir. İhtiyaç duyulan heparin ile salin miktarı değişirken, kalpten akan şeffaf sıvı işlemin tamamlandığını gösterir. Beyin tamamen ve uygun şekilde perfüze edilmelidir,…
The authors have nothing to disclose.
Aimee Rogers’a uygulamalı eğitim ve sürekli ürün desteği sağladığı için teşekkür ederiz. Dr. Amanda Burke’e devam eden sorun giderme ve açıklayıcı tartışmalar için teşekkür ederiz. Meredith Joheim ve UAMS Bilim İletişim Grubu’na bu makalenin gramer düzenlemesi ve biçimlendirmesi için teşekkür ederiz. Bu çalışma NIH R25GM083247 ve NIH 1R01CA258673 (A.R.A.) tarafından desteklenmiştir.
1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 02-682-003 | Basix, assorted color |
15 mL Falcon Tubes | Becton Dickinson Labware Europe | 352009 | Polystyrene |
25 mL Serological Pipets | Fisher Scientific | 14-955-235 | |
5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube | Falcon | 352052 | |
500 mL Vacuum Filter/ Storage Bottle System | Corning | 431097 | |
70 μm cell strainer | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
Adult Brain Dissociation Kit | Miltenyi Biotec | 130-107-677 | Contains Enzyme P, Buffer Z, Buffer Y, Enzyme A, Buffer A, Debris Removal Solution |
Aluminum Foil | Fisher Scientific | 01-213-105 | |
Anti-ACSA-2-PE-Vio770, mouse, clone REA969 | Miltenyi Biotec | 130-116-246 | |
Anti-Myelin Basic Protein | Sigma-Aldrich | M3821-100UG | |
Anti-PSA-NCAM-PE, human, mouse and rat, Clone 2-2B | Miltenyi Biotec | 130-117-394 | |
BD LSRFortessa | BD | ||
BSA | Sigma-Aldrich | A7906-50G | |
CD11b-VioBlue, mouse, Clone REA592 | Miltenyi Biotec | 130-113-810 | |
CD31 Antibody | Miltenyi Biotec | 130-111-541 | |
Ceramic Hot Plate Stirrer | Fisher Scientific | 11-100-100SH | |
Dimethyl Sulfoxide | Fisher Scientific | BP231-100 | |
Ethanol | Pharmco by Greenfield Global | 111000200 | |
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
Fine Scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14060-09 | Perfusion |
FlowJo | BD | (v10.7.0) | |
gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
Gibco DPBS (1X) | ThermoFisher Scientific | 14190144 | |
Glass Beaker | Fisher Scientific | 02-555-25A | |
Heparin sodium | Fresenius Kabi | 504011 | |
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | ThermoFisher | L34965 | |
Magnetic Stir Bar | Fisher Scientific | 14-513-51 | |
Noyes Spring Scissors | Fine Science Tools | 15012-12 | Dissection |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 441244-3KG | Prilled, 95% |
Pipette tips GP LTS 20 µL 960A/10 | Rainin | 30389270 | |
Pipette Tips GP LTS 250 µL 960A/10 | Rainin | 30389277 | |
Pipette tips RT LTS 1000 µL FL 768A/8 | Rainin | 30389213 | |
Rainin Pipet-Lite XLS (2, 20, 200, 1000 μL) | Rainin | 30386597 | |
RBXMO FITC XADS | Fisher Scientific | A16167 | |
Round Ice Bucket with Lid | Fisher Scientific | 07-210-129 | |
Round-Bottom Tubes with Cell Strainer Cap | Falcon | 100-0087 | |
S1 Pipet Fillers | ThermoFisher Scientific | 9541 | |
Spatula & Probe | Fine Science Tools | 10090-13 | Dissection & Perfusion |
Surflo Winged Infusion Set 23 G x 3/4" | Termuno | SV-23BLK | Butterfly needle |
Test Tube Rack | Fisher Scientific | 14-809-37 | |
Thermo Scientific Legend XTR Centrifuge | ThermoFisher | discontinued | Or other standard table top centrifuge |
Variable-Flow Peristaltic Pump | Fisher Scientific | 13-876-2 | Low-flow model |
VetFlo Starter Kit for Mice | Kent Scientific | VetFlo-MSEKIT | Anesthesia mask, tubing, induction chamber, charcoal canisters |
VetFlo Vaporizer Single Channel Anesthesia System | Kent Scientific | VetFlo-1210S | 0.2–4 LPM |
Vi-CELL XR Cell Viability Analyzer | Beckman Coulter Life Sciences | 731196 | Cell Counting |
Vi-CELL XR 4 Bags of Sample Vials | Beckman Coulter Life Sciences | 383721 | Cell Counting |