프로토콜은 복잡한 lysate 기반 세포 없는 시스템에서 대사 반응을 연구하기 위한 굴절 지수 또는 질량 분광 검출에 결합된 고성능 액체 크로마토그래피 방법을 설명합니다.
표적 생합성을 위한 세포 대사를 엔지니어링하려면 엔지니어가 세포의 생존 요구 사항을 중심으로 작업할 때 광범위한 설계-빌드-테스트-학습(DBTL) 주기가 필요할 수 있습니다. 또는 셀 프리 환경에서 DBTL 주기를 수행하면 이 프로세스를 가속화하고 호스트 호환성에 대한 우려를 완화할 수 있습니다. 세포 없는 신진 대사 공학(CFME)에 대한 유망한 접근법은 신진대사활성 원유 세포 추출물을 바이오 제조플랫폼으로 활용하고 수정된 단백질과 경로를 빠르게 발견하고 프로토타이핑하는 데 활용합니다. 이러한 기능을 실현하고 CFME 성능을 최적화하려면 lysate 기반 셀 프리 플랫폼의 메타볼로메를 특성화하는 방법이 필요합니다. 즉, 분석 도구는 표적 대사산물 변환의 개선을 모니터링하고 용액 대사를 조작할 때 대사산물 플럭스로의 변경을 해명하기 위해 필요합니다. 여기서, 대장균 S30 용액에서 대사산물 생산 및 플럭스를 특성화하기 위해 광학 또는 질량 분광 검출과 결합된 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 이용한 대사산물 분석이 적용되었다. 구체적으로, 본 보고서는 굴절률 검출(RID)을 사용하여 HPLC 분석을 위한 CFME 분석에서 샘플의 제조를 설명하여 저비용 기판(즉, 포도당)을 다양한 고부가가치 제품으로 변환하는 과정에서 중앙 대사 중기 및 부산물의 생성을 정량화한다. CFME 반응에서 대사 산물 변환의 분석은 특정 대사 산물 수율을 특성화하고 시작 재료로부터 대사 플럭스를 반사하는 강력한 도구인 질량 분석법(MS/MS)과 결합된 반전 상 액체 크로마토그래피를 통해 13C표지된 포도당으로 공급되는 분석도 제시된다. 전부, CFME lysate 신진 대사에 이러한 분석 방법을 적용하면 더 빠르거나 새로운 신진 대사 엔지니어링 작업을 실행하기위한 대체 플랫폼으로 이러한 시스템의 발전을 가능하게.
화학 생산을 위한 엔지니어링 미생물의 한계는 경쟁세포 생존 기능이 없는 시험관내에서 생화학반응을 재구성함으로써 해결될 수있다. 더욱이, 개방반응 환경(즉, 세포막의 부재)은 조작에 더 순종하며 살아있는 세포에 비해 모니터링하기 쉽다. 세포없는 대사 공학 (CFME)의 이 기본 개념은 지금까지 미생물 세포 공장에서 제시된 것보다 더 높은 크기의 생산 메트릭으로 수소 및 단테르펜과 같은 귀중한 화학 물질을 합성하는 대사 경로의 재구성에 의해 우아하게 입증되었습니다1,2,3 . 그러나 전체 경로를 정화하는 방법은 현재 시간과 비용에 의해 제한됩니다. 대안적으로, 세포없는 대사 시스템은 전체 통로 재구성에 비해 신속하고 저렴한 방법을 통해 조세포 추출물로부터 유래 될 수있다4. 세포 추출물에 유지되는 중앙 대사는 24h5,6이상에 대한 중앙 대사 전구체를 생성하기 위해 완충 된 솔루션에서 에너지 기판 (예를 들어, 포도당 및 효소 공동 요소) 및 소금으로 보충 될 수 있습니다. 용액 계 CFME 반응에 외인성 효소를 첨가하면포도당의보다 복잡한 생체 변환을 하이 티터4,6,7에서더 가치 있는 화학물질로 변환할 수 있습니다. 수율은 세포와 같은 대사 복잡성으로 인해 이러한 시스템에서 손상되는 경향이 있지만, 더 높은 수율 변환을 위해 lysate 프로테옴을 큐레이터하는 독특한 방법은7,8개발되고있다.
용액 기반 세포 없는 시스템에서 대사 변환을 수행의 용이성 또는 생체2,9에서이러한 설계를 구축하고 테스트하기 전에 높은 처리량으로 새로운 경로를 프로토타이핑하는 이러한 우수한 플랫폼을 만든다. 응용 프로그램에 대 한, 신진 대사 변환을 모니터링 하거나 lysates에 신진 대사 플럭스에 전반적인 변화를 관찰 하는 도구는 CFME의 발전에 필수적인. 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)는 CFME 반응의 화학 성분을 고해상도로 분리하는 데 사용될 수 있으며 대사산물 정량화5,10에대한 광학 또는 질량 분광 검출기에 결합될 수 있다. HPLC의 기본 원리는 용매(즉, 모바일 상)에 용해되고 컬럼을 통해 펌핑된 해석물이 특정 컬럼 패킹 재료(즉, 고정상)11과상호 작용한다는 것이다. 그들의 화학 적 특성에 따라, 이러한 분석을 전시 하는 그들은 결국 고정 된 단계에서 발레 하 고 검출기에 이동 단계에 의해 수행 되기 전에 다양 한 보존 시간을 전시. 이 보고서는 RID 및 MS/MS 검출을 활용하는 HPLC 기반 방법을 통해 대장균 용액 계 CFME 반응의 준비 및 분석을 자세히 설명합니다.
굴절률 검출(HPLC-RID)에 결합된 HPLC는 중앙 대사 전구체 및 최종 제품을 신속하게 식별할 수 있는 일반적으로 접근할 수 있는 방법입니다. 간단히, RID는 어떻게 해석이 모바일12상에의해 빛의 편향을 바꾸는지 측정한다. 그런 다음 샘플의 표적 별채에 대응하는 RID 신호는 표준 솔루션의 RID 신호와 비교하여 정량화될 수 있습니다. CFME 응용 프로그램에서, 이러한 검출 모드는 크기 배제 및 리간드 교환 메커니즘, 또는 이온 중재 된 파티션 크로마토그래피5,6,8,13의조합을 기반으로 화합물을 분리하는 HPLC 열과 가장 일반적으로 사용되었습니다. 이 특정 기술은 포도당과 같은 설탕 기판의 소비뿐만 아니라 용액계 CFME 반응8에서간결, 젖산, 포르메이트, 아세테이트 및 에탄올과 같은 발효 제품의 형성을 신속하게 정량화하는 데 사용됩니다. HPLC를 통해 이러한 화합물의 농도 변화를 기록하는 것은 조세포 추출물의 잠재력을 해명하여 중앙 대사 전구체를 풀로 하고, 리자6,8,14의포도당에서 포도당에서 복잡한 대사 변환 동안 발효 경로를 통해 통로 플럭스가 어떻게 리디렉션되는지 이해하는 데 유용하다. 대장균 세포 추출물의 정액 CFME 연구는 발효 화합물이 포도당 이화작용의 최종 제품으로 축적되고 외인성효소6,15를과발현하는 용액의 원치 않는 부산물로서도 발생한다는 것을 확인한다. 발효 대사가 당화 반응8을유지하기 위해 공동인자(즉, NAD(P)H 및 ATP)의 레독스 등가물을 재생하는 데 필요한 역할을 한다는 것이 좋습니다. 따라서 발효 제품을 분리하도록 설계된 HPLC 기반 광학 검출 방법은 다양한 lysate 기반 CFME 작업을 실행할 때 유용하고 일반적으로 적용되는 도구입니다.
CFME는 탄수화물, 유기산 또는 알코올4가아닌 신진 대사 최종 제품을 축적하기 위해 구현될 수 있다. 합성되는 만큼 빠르게 소비되는 중급자의 측정도 바람직한10일수있다. HPLC-RID는 비용과 난이도면에서 액세스할 수 있지만, 이 방법은 보존 시간에 따라 대사 산물만 구별하는 능력에 의해 제한됩니다. 액체 크로마토그래피가 MS/MS 검출(LC-MS/MS)16에결합될 때 더 넓은 범위의 대사산물을 분석할 수 있다. 이 방법에 의해, 이동 상에서 의 별과는 각 분자의 질량 및 전하 특성에 따라 이온화 되고 분화된다. 대사 산물의 질량 투-충전(m/z) 비율과 열의 보존 시간을 모두 지식으로 대부분의 대사 중급자 및 고해상도16을가진 최종 제품의 분리를 용이하게 한다. 이러한 검출 기술은 또한 나노 액체 크로마토그래피와 결합될 수 있으며, 이는 유량과 시료 주입 량을 훨씬 더 낮게 제공하여 복잡한 용해배경(17)에서소분자를 보다 민감하게 검출할 수 있다. LC-MS/MS는 통합 된 레이블이 aalytes의 m / z 값18에변화를 부여하기 때문에 동위원소 라벨링과 함께 추가로 적용 할 수 있습니다. 13C6-포도당 기판으로 보충된 CFME반응에서 추출된 타임포인트 측정은 따라서 보충 된 포도당에서 특별히 파생된 최종 또는 부산물을 결정할 수 있다. 이 동위원소 추적 방법은 아직 CFME 연구에서 일반적으로 적용되지 않지만, 특히 이러한 반응에서 염반작용(즉, 아세테이트 및 글루타메이트)이 이차기판으로촉매되기 때문에 lysate 기반 CFME 시스템의 대사 전환을 이해하는 강력한 도구이다. 이 기술을 활용하면 lysates에서 포도당 대사의 포괄적 인 그림을 그릴 수 있으며, 오늘날까지완전히 이해되지는 않습니다. 여기서, 프로토콜은 나노전기분무분무소(nano ESI) MS/MS에 결합된 나노액체 크로마토그래피를 위한 방법을 상세히 설명하여 포도당 대사의 가능한 모델을 심문하는 데 사용될 수 있으며, 특히 대장균 리자츠(도1)에서. 이 모델은 풍부한 미디어5,6,8,14에서자란 균주에서 유래한 대장균 리세이트에서 활성 중인 발효 경로 및 펜토제 인산염 경로의 보고를 기반으로 한다. 이 기술은 또한 아미노산 생산을 조사하는 데 사용되며, 현재 는 용해에서 포도당에서 아미노산 의 해부학에 대한 현재 지식이 방향족 아미노산7의 합성과 같은 몇 가지 예로제한됩니다. 이러한 경로(즉, 유기산, 설탕 인산염 및 아미노산)에서 최종 제품 및 중간체의 대부분 극성 특성을 감안할 때 역단계 액체 크로마토그래피가 여기에 활용되었습니다. 이 기술은 극성 고정 단계에서 용출하여 극성 화합물을 분리합니다. 이러한 화합물은 적어도 하나의 음의 기본 충전으로 분석물의 검출을 허용하고 따라서 산성 화합물을 검출하는 데 유용 부정적인 이온 모드에서 나노 ESI에 의해 이온화되었다. 이 기술은 포도당 유래 13C 통합 대사 산물을 분석하기 위해 여기에서 사용되며 lysates에서 포도당 대사를 이해하기 위한 LC-MS/MS의 유용성을 보여줍니다.
설명된 HPLC-RID 접근법은 시간이 지남에 따라 주요 유기산 및 알코올 제품으로 설탕 기판 소비량과 후속 변환을 성공적으로 정량화하는 데 사용할 수 있습니다. 또한 이 프로토콜은 단일 모바일 단계를 사용하여 간단한 동면 방법을 채택하고 최소한의 샘플 준비가 필요하며 간단한 표적 다운스트림 분석을 허용합니다. HPLC-RID 방법으로 측정된 Aalytes는 보존 시간, 따라서 선택한 컬럼 수지와의 상호 작용에 의해서만 구별됩니다. 여기에서 이용된 HPLC 컬럼은 크기 배제 및 리간드 교환(즉, 이온 중재된 분할 크로마토그래피)을 결합하여 탄수화물, 유기산 및 알코올을 분리하도록 특별히 설계되었습니다. 따라서, 상기 상기 방법은, 탄수화물 기판의 보다 표적화된 분석에 유용하고, 포도당 발효 경로의 선택 단산물은 주로 용이성 기반 바이오변환8,15,21을용이하게 하고 활력을 불어넣을 것으로 예상된다. 그러나, 이 프로토콜세포 추출물에서 다른 신진 대사 경로의 활성화에 대 한 계정 되지 않습니다. 다른 크로마토그래피 분리 기술(즉, 수성 성작용 크로마토그래피), 그라데이션 용출 방법, 더 복잡한 시료 제제(즉, 파생), 및 다른 광학 검출기(예: 자외선 또는 증발광 산란 검출기)를 사용하는 파이프라인은 아미노산 및 가산염 과같은 다른 대사산물을 검출하는 데 사용될 수있다. . 또는 LC-MS/MS를 사용하여 용해 대사를 연구하는 글로벌 접근 방식을 취할 수 있습니다.
설명된 LC-MS/MS 방법은 광범위한 대사산물을 측정하고 식별하기 위한 단일 워크플로우입니다. LC-MS/MS는 고해상도16을가진 유지 시간 및 m/z 비율로 대사 산물을 구별하는 민감도 및 능력 때문에 메타볼로메 프로파일링을 위한 최첨단 분석 도구이다. 중앙 탄소 대사 경로 와 아미노산 분석에 초점을 맞추고, 음성 모드 MS/MS는 특히 극성 유기산, 설탕 인산염 및 아미노산을 검출하기 위해 구현되었다. 나노 액체 크로마토그래피 기술과 결합된 이 방법은 복잡한 용해배경(17)에서소분자를 검출하는 데 높은 민감도를 제공한다. 그러나, 설명된 LC-MS/MS 프로토콜의 제한은 50m/z의 검출 한계이며, 이는 포도당 대사의 주요 제품인 에탄올의 측정을 배제하고, 상세한 HPLC-RID 방법에 의해 쉽게 정량화되는 상근제입니다. LC-MS/MS에 비해 HPLC-RID는 비용과 난이도 면에서 상대적 접근성의 추가적인 이점을 가지고 있습니다. 후자의 관점에서, 여기에 설명된 LC-MS/MS 방법을 트러블슈팅하려면 질량 분석에 대한 어느 정도의 전문지식이 필요할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고 MS 검출은 복잡한 용액 대사망(18)을통해 보충기판에서 탄소 이동을 이해하는 훌륭한 기술인 메타볼로메에서 표기된 동위원소를 추가로 구별할 수 있기 때문에 RID에 비해 유일하게 매력적인 응용 분야입니다. 이러한 접근법은 13 C 6-포도당으로반응을 보완하고 다운스트림 13C 통합 대사 산물의 상대적 풍부 값을 분석하여 여기에 적용되었다. 분석은 액티브하고 비활성 통로의 정의를 허용하고, 이전에 보고된 가정을 지원하고 lysates에 있는 신진 대사 플럭스에 관하여 새로운 통찰력을 제공했습니다. 특정 분석을 위해 메서드 내에서 수정할 수도 있습니다. 예를 들어, 13C표지 표적 화합물의 표준 용액은 시간이 지남에 따라 포도당 유래 분자의 절대 정량적 측정을 달성하고 플럭스 분포에 대한 결론을 내리기 위해 샘플과 함께 분석될 수 있습니다. 양전하 화합물을 더 잘 감지하면 양수 모드 감지를 위해 조정된 .meth 파일로 시퀀스를 실행하여 현재 워크플로 내에서 활성화할 수도 있습니다.
두 가지 설명된 방법 모두에서 분석 샘플링이 편리하게 자동화되어 높은 재현성을 보장합니다. 또한 적절한 계측기 취급 관행과 유지 보수가 관찰되는 한 원활한 분석 실행을 기대할 수 있습니다. 이러한 도구를 사용하여 CFME 반응을 분석할 때 샘플링의 업스트림 및 다운스트림을 보다 중요하게 고려해야 합니다. 샘플 준비 중에 시간 과정 컨트롤이 시간 제로를 대표하는 것이 중요합니다. 여기서, 단백질은 신진 대사 반응을 중단하기 위하여 산성화에 의해 lysates에서 침전되었습니다. 시간 제로 샘플의 경우, 산용매는 포도당을 포함하는 반응 혼합을 추가하기 전에 용액과 결합되었다. 트리클로로아세트산을 가진 산성화는 HPLC-RID데이터(그림 2)에도시된 바와 같이 포도당이 시간 제로에서 대사되지 않도록 효과적으로 보장하였다. 보고된 LC-MS/MS 분석에서 포도당 대사를 담금질하는 유사한 절차가 수행되었지만, 13C-표지대사산물은 이후 시점에서 추출된 샘플에 비해 상당히 낮은 풍부값임에도 불구하고 시간 제로 샘플에서 검출되었다. 더욱이, 이러한 관측은 글리코리시스의 중간체로 제한되었다. 데이터는 반응이 매우 민감한 방법에 의해 검출되는 추출 용매를 가진 산성화 후에 당화 활성의 어느 정도를 유지한다는 것을 건의합니다. 그러나 이 활동의 범위는 정량화되어야 합니다. 이전 연구는 산성 추출 용매가 중간 혈당 반응을 충분히 담금질하지 않을 수 있지만 상당한 포도당 소비를 중지 할 수 있다고보고10. 이 여기에 사용 되는 시스템에서 더 조사 될 남아 있는 동안, 시간 제로 와 이후 시간 점 샘플 사이 상대적인 풍부 한 값에 있는 급격한 변화는 포도 당 물질 대사에 있는 동향으로 해석될 수 있습니다. 그러나 대체 담금질 방법을 탐구하는 것은 특히 대사중급제(10)의절대수량을 얻기 위해 유사한 응용 분야에서 권장된다. 또한 다운스트림 소프트웨어 분석 중 의 모범 사례도 준수해야 합니다. RID 신호에서 피크 영역을 수동으로 통합하여 사람의 오류를 줄일 때 일관성이 필수적입니다. 수동으로 통합된 피크 영역이 샘플의 대사산물 농도를 정량화하는 데 사용될 때마다 표준의 피크 영역에도 수동 통합을 적용해야 합니다. 대상 LC-MS/MS 분석 전반에 걸쳐 MS 품질 브라우저를 사용하여 수동 피크 검사를 통해 MZmine 분석의 잠정 주석을 검증해야 하며, m/z 기능은 계산된 질량 오류가 허용되는 경우에만 주석을 달아야 합니다. 여기서 이러한 분석은 동위원소 검색을 위한 포괄적이고 강력한 소프트웨어가 아직 확립되지 않았기 때문에 제한된 대상 집합에 대해 수동으로 수행되었습니다. 그러나, 13C 표지된 대사산물을 검색하기 위한 이러한 자동화된 방법은 현재 등장하고 있으며 중앙 탄소대사(25)를넘어 용재 프로파일링과 같은 더 복잡한 분석도 간소화할 것이다.
고급 액체 크로마토그래피는 복잡한 대사혼합물(11)에서소분자를 분리하기 위한 견고하고 널리 적용되는 방법입니다. 설명된 방법은 이 분리 기술을 굴절지수 또는 질량 분광 검출과 결합하여 lysate-based CFME 반응에서 대사산물 변환을 성공적으로 분석합니다. HPLC-RID 및 LC-MS/MS는 활성 리자트 대사 프로파일링을 위한 개별적으로 강력한 도구이며, 상호 보완성은 각 기술의 고유한 한계를 해결하기 위해 더욱 활용될 수 있습니다. 보고된 방법은 용액 대사를 이해하고, 표적 대사산물 변환의 개선을 모니터링하고, 용액 대사대사를 조작할 때 대사산물 플럭스로의 변경을 해명하는 데 활용할 수 있기 때문에 CFME의 적용 및 개발을 가능하게 한다.
The authors have nothing to disclose.
이 연구는 유전체 과학 프로그램, 미국 에너지부, 과학, 생물학 및 환경 연구실이 식물 미생물 인터페이스 과학 초점 영역 (http://pmi.ornl.gov)의 일환으로 후원했습니다. 오크 리지 국립 연구소는 UT-Battelle에 의해 관리됩니다, LLC, 계약에 따라 미국 에너지부에 대한 DE-AC05-00OR22725. 이 원고는 미국 에너지부와 계약 DE-AC05-00OR22725에 따라 UT-Battelle, LLC에 의해 작성되었습니다. 미국 정부는 출판 기사를 수락함으로써 미국 정부가 이 원고의 출판 양식을 게시하거나 재현하거나 다른 사람이 미국 정부의 목적을 위해 그렇게 할 수 있도록 독점, 지불, 돌이킬 수없는 전 세계 라이센스를 보유하고 있음을 인정합니다. 에너지부는 DOE 공공 접근 계획 (http://energy.gov/downloads/doe-public-access-plan)에 따라 연방 정부가 후원하는 연구의 이러한 결과에 대한 대중의 접근을 제공 할 것입니다.
0.22 μm centrifuge tube filters (spin columns) | Corning Costar | 8160 | |
1.5 mL microcentrifuge tubes | VWR | 87003-294 | |
1260 Infinity Binary LC Pump | Agilent | G1312B | HPLC-RID system |
1260 Infinity High Performance Degasser | Agilent | G4225A | HPLC-RID system |
1260 Infinity Refractive Index Detector | Agilent | G7162A | HPLC-RID system |
1260 Infinity Standard Autosampler | Agilent | G1329B | HPLC-RID system |
13C6-glucose | Sigma-Aldrich | 389374 | CFME reaction mix component (LC-MS/MS) |
500 mL 0.20 μm pore (PES membrane) filter | VWR | 10040-436 | |
Acetonitrile (LC/MS grade) | Fisher Scientific | A955 | Solvent preparation for LC-MS/MS |
Adenosine triphosphate | Sigma-Aldrich | A7699 | CFME reaction mix component |
Aminex HPX 87-H column | Bio-rad | 1250140 | Chromatography column for HPLC-RID |
Ammonium acetate (LC/MS grade) | Fisher Scientific | A11450 | Solvent preparation for LC-MS/MS |
Ammonium glutamate | Sigma-Aldrich | G1376 | CFME reaction mix component |
Autosampler vial caps (yellow, snap) | Thermo Scientific | C4011-50Y | Sample storage/delivery for LC-MS/MS |
Autosampler vials (0.30 mL, polypropylene) | Wheaton | W225181 | Sample storage/delivery for LC-MS/MS |
Benchtop microcentrifuge | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
Bis-Tris | Sigma-Aldrich | B9754 | CFME reaction mix component |
Coenzyme A (CoA) | Sigma-Aldrich | C4282 | CFME reaction mix component |
D-dextrose (Glucose) | VWR | BDH9230 | CFME reaction mix component |
Dipotassium phosphate | Sigma-Aldrich | P8281 | CFME reaction mix component |
Ethanol | Fisher Scientific | BP2818100 | Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID) |
Formic acid (LC/MS grade) | Thermo Scientific | 85178 | Solvent preparation for LC-MS/MS |
Fused silica (internal diameter of 100 μm, external diameter of 375 μm) | Polymicro Technologies | WM22005-ND | Chromatography column for LC-MS/MS |
Glacial acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | S30 buffer ingredient |
Isopropanol (LC/MS grade) | Fisher Scientific | A461 | Solvent preparation for LC-MS/MS |
Kinetex 5 μm C18 stationary phase (100 Å) | Phenomenex | N/A; special order | Chromatography column for LC-MS/MS |
LTQ Orbitrap Velos Pro Mass Spectrometer | ThermoFisher Scientific | N/A; special order | Mass spectrometer for LC-MS/MS |
Magnesium acetate | Sigma-Aldrich | M5661 | S30 buffer ingredient |
Magnesium glutamate | Sigma-Aldrich | 49605 | CFME reaction mix component |
Methanol (LC/MS grade) | Fisher Scientific | A456 | Solvent preparation for LC-MS/MS |
NAD+ | Sigma-Aldrich | N0632 | CFME reaction mix component |
Nanospray Ionization Source | ThermoFisher Scientific/Proxeon | ES071 (newest model) | Mass spectrometer for LC-MS/MS |
OpenLab CDS (Online) Software | Agilent | Version 2.15.26 | Chromatography Data System for acquiring and analyzing HPLC data |
Orbitrap Velos Pro LTQ Tune Plus Software | Thermo | Version 2.7 | Software for tuning the LC-MS/MS system |
Potassium acetate | Sigma-Aldrich | P1190 | S30 buffer ingredient |
Potassium glutamate | Sigma-Aldrich | G1501 | CFME reaction mix component |
Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5415 C | |
Screw caps (with septa, 9 mm) | Supelco | 29315-U | Sample storage/delivery for HPLC-RID |
Screwthread glass vials (2 mL) | Supelco | 29376-U | Sample storage/delivery for HPLC-RID |
Sodium acetate | Sigma-Aldrich | 241245 | Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID) |
Sodium formate | Sigma-Aldrich | 247596 | Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID) |
Sodium lactate | Sigma-Aldrich | 71716 | Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID) |
Succinic acid | Sigma-Aldrich | 398055 | Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID) |
Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 258105 | Solvent preparation for HPLC-RID |
Trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6399 | |
Tris-acetate | GoldBio | T-090-100 | S30 buffer ingredient |
Ultimate 3000 LC with autosampler | Dionex | Solvent Rack: SRD-3600 | Liquid chromatography system for LC-MS/MS analysis |
Ultimate 3000 LC with autosampler | Dionex | Rapid Separation Binary Pump: HPG-3400RS | Liquid chromatography system for LC-MS/MS analysis |
Ultimate 3000 LC with autosampler | Dionex | Rapid Separation Well Plate Autosampler: WPS-3000TRS | Liquid chromatography system for LC-MS/MS analysis |
Water (LC/MS grade) | Fisher Scientific | W6500 | Solvent preparation for LC-MS/MS |
Xcalibur Software | Thermo | Version 3.0.63 | Data acquisition and interpretation software for LC-MS/MS |