协议描述了高性能液相色谱方法,以及用于研究复杂赖酸基无细胞系统代谢反应的折射指数或质谱检测。
工程细胞代谢目标生物合成可能需要广泛的设计-构建-测试-学习(DBTL)周期,因为工程师围绕细胞的生存要求工作。或者,在无细胞环境中执行 DBTL 循环可以加速此过程并缓解与主机兼容性的担忧。无细胞代谢工程 (CFME) 的一种很有前途的方法利用代谢活性粗细胞提取物作为生物制造和快速发现和原型化改性蛋白质和途径的平台。实现这些功能并优化 CFME 性能需要方法来描述基于 lysate 的无细胞平台的代谢体。即,分析工具对于监测目标代谢物转化的改进以及在操纵赖萨特代谢时对代谢通量的改变是必要的。在这里,使用高性能液相色谱 (HPLC) 以及光学或质谱检测的代谢物分析应用于 大肠杆 菌 S30 解变物的代谢物生产和通量特征。具体来说,本报告描述了使用折射指数检测 (RID) 为 HPLC 分析准备 CFME 解质样品,以量化中央代谢中间体和副产品的生成,将低成本基板(即葡萄糖)转化为各种高价值产品。此外,还介绍了通过反向相液相色谱加上串联质谱 (MS/MS) 来喂养 13个 C 标记葡萄糖的 CFME 反应中的代谢物转化分析,这是一种从起始材料中描述特定代谢物产量和溶解代谢通量的强大工具。总之,将这些分析方法应用于 CFME 解酶代谢,使这些系统能够作为执行更快或新颖代谢工程任务的替代平台。
化学生产工程微生物的局限性可以通过在体外重新总结生物化学反应来解决,因为体外缺乏相互竞争的细胞生存功能。此外,开放反应环境(即没有细胞膜)更易于操作,与活细胞相比更容易监测。这种无细胞代谢工程(CFME)的基础概念通过重组代谢途径,将氢气和单体等有价值的化学物质与生产指标合成,其数量级高于微生物细胞工厂迄今提出的1、2、3 .然而,净化整个途径的方法目前受到时间和成本的限制。或者,无细胞代谢系统可以通过快速和廉价的方法从粗细胞提取物中提取,相对于整个路径重组4。保留在细胞提取物中的中央代谢可以补充能量基质(例如葡萄糖和酶同因子)和缓冲溶液中的盐,以产生超过24h5、6的中央代谢前体。在基于溶酶的CFME反应中加入外源酶,使葡萄糖在高滴答声4、6、7中转化为更有价值的化学物质的更复杂的生物转化。虽然由于细胞状代谢的复杂性,这些系统的产量往往会受到影响,但用于高产转化的解质蛋白体的独特方法已经并正在开发中。
在基于解质的无细胞系统中进行代谢转化的便利性,使得这些优秀的平台要么将化学制造完全移出细胞,要么在构建和测试这些设计之前,在活体2、9中构建和测试高吞吐量的新路径。无论是应用,监测代谢转化的工具,还是观察解质中代谢通量整体变化的工具,都是CFME进步不可或缺的一部分。高性能液相色谱 (HPLC) 可用于将 CFME 反应的化学成分与高分辨率分离,并可与光学或质谱探测器耦合,用于代谢物定量5、10。HPLC 的基本原则是,溶剂(即移动相)溶解并通过列泵送的分析物将与特定列包装材料(即静止相)11进行交互。根据其化学特性,这些分析在最终从静止相中分离并由移动相携带到探测器之前表现出不同的保留时间。本报告详细介绍了通过基于 HPLC 的方法利用 RID 和 MS/MS 检测对基于大肠杆菌的 CFME 反应进行制备和分析。
HPLC 耦合折射指数检测 (HPLC-RID) 是一种通常可快速识别中央代谢前体和最终产品的方法。简言之,RID 测量分析如何通过移动阶段12改变光的偏转。然后,通过与标准解决方案的 RID 信号进行比较,可以量化样本中与目标分析物对应的 RID 信号。在 CFME 应用中,这种检测模式最常用于 HPLC 列,该列基于大小排除和配体交换机制(离子介质分区色谱5、6、8、13)的组合将化合物分开。这种特殊的技术用于快速量化糖基的消耗,如葡萄糖,以及形成发酵产品,如精密,乳酸盐,富甲酸盐,醋酸盐和乙醇在溶酶为基础的CFME反应8。通过 HPLC 记录这些化合物的浓度变化对于阐明粗细胞提取物汇集中央代谢前体的潜力和了解在从溶酶6、8、14中的葡萄糖进行复杂代谢转换过程中,通路通量如何通过发酵通路重定向都很有用。大肠杆菌提取物中的开创性CFME研究证实,发酵化合物作为葡萄糖代谢的最终产物积累,在溶酶中也作为不需要的副产品发生,过度表达外源性酶6,15。有人建议,发酵代谢在再生共生物(即NAD(P)H和ATP)的氧化物等价物以维持糖解反应8方面起着必要的作用。因此,基于 HPLC 的光学检测方法旨在分离发酵产品,是执行各种基于解剖的 CFME 任务时有用且常用的工具。
CFME可以实施积累代谢最终产品,不是碳水化合物,有机酸,或酒精4。中间体的测量,消耗一样快,因为他们被合成可能也是可取的10。虽然 HPLC-RID 在成本和难度方面是可访问的,但这种方法受制于它仅根据保留时间区分代谢物的能力。当液相色谱与MS/MS检测(LC-MS/MS)16耦合时,可以分析更广泛的代谢物。通过这种方法,根据每个分子的质量和电荷特性,对移动相中的分析物进行电电和差分检测。了解代谢物的质量对电荷(m/z)比率和柱子上的保留时间,从而促进大多数代谢中间体和高分辨率16的最终产品的分离。这种检测技术还可以与纳米液体色谱相结合,后者提供更低的流速和样品注射量,从而能够更灵敏地检测复杂解化物背景17中的小分子。LC-MS/MS 可以与同位素标签一起应用,因为合并的标签会传递分析仪 m/z 值18的变化。从 CFME 反应中提取的时间点测量,辅以13C6葡萄糖基板,从而确定特别来自补充葡萄糖的最终或副产品。虽然这种同位素追踪方法尚未在CFME研究中普遍应用,但它是了解基于赖氨酸的CFME系统代谢转换的有力工具,特别是因为这些反应中的盐抗(即醋酸酯和谷氨酸)也作为次要基材19被催化。因此,利用这项技术可以全面了解溶酶中的葡萄糖代谢,而时至今日,这种新陈代谢还没有完全被理解。在此,协议详细说明了纳米液体色谱加上纳米电极电解 (nano ESI) MS/MS 的方法,可用于询问葡萄糖代谢的可能模型,特别是在大肠杆菌解剖中(图 1)。该模型是基于发酵途径和五氯苯甲酸酯通路活跃于大肠杆菌解析物中的报告,这些菌株来自富集介质5、6、8、14中生长的菌株。该技术还用于研究氨基酸的产生,因为目前关于裂解酶中葡萄糖的氨基酸解剖的知识仅限于一些例子,如芳香氨基酸7的合成。鉴于这些通路中最终产品和中间体(即有机酸、磷酸糖和氨基酸)的极性,这里使用了反相液相色谱。该技术通过从非极性静止阶段中分离出极地化合物。然后,这些化合物通过纳米 ESI 在负离子模式下电镀,从而允许检测至少一个负基本电荷的分析物,因此可用于检测酸性化合物。此技术用于分析葡萄糖衍生的13C 结合代谢物,并演示 LC-MS/MS 在了解溶酶中的葡萄糖代谢方面的作用。
概述的 HPLC-RID 方法可用于成功量化糖基板消耗量,并随时间推移转化为赖沙特中央代谢的主要有机酸和酒精产品。此外,此协议采用单个移动相位的简单等同位素方法,需要最少的示例准备,并允许进行简单的有针对性的下游分析。HPLC-RID 方法测量的分析方法仅以保留时间为区分标准,因此它们与选定的柱树脂的相互作用。这里使用的 HPLC 列特别设计用于通过将大小排除和配体交换(即离子介导分区色谱)相结合来分离碳水化合物、有机酸和酒精。因此,上述方法有助于更有针对性地分析碳水化合物基质和葡萄糖发酵途径的最终产品,预计这些最终产品将主要促进和激励基于溶酶的生物转化8、15、21。但是,此协议不考虑细胞提取物中其他代谢通路的激活。采用其他色谱分离技术(即亲水相互作用色谱)、梯度脱粒方法、更复杂的样品制备(即分源化)和不同的光学探测器(如紫外光或蒸发光散射探测器)的管道可用于检测其他代谢物,如氨基酸和磷酸糖23、24 .或者,使用LC-MS/MS可以采用全球方法研究赖沙酸代谢。
描述的LC-MS/MS方法是测量和识别更广泛代谢物的单一工作流程。LC-MS/MS 是一种最先进的代谢分析工具,因为它具有通过保留时间和 m/z 比率(分辨率为16)来区分代谢物的灵敏度和能力。以中央碳代谢途径和氨基酸代谢为重点,实施了负模式MS/MS,以专门检测极地有机酸、磷酸糖和氨基酸。结合纳米液体色谱技术,该方法为检测复杂解化物背景17中的小分子提供了高灵敏度。然而,在分析基于溶酶的CFME代谢方面,描述的LC-MS/MS协议的一个限制是其50米/z的下检测极限,这排除了乙醇的测量,乙醇是溶酶葡萄糖代谢的主要产品,以及甲基醇,否则很容易被详细的HPPC-RID方法量化。与LC-MS/MS相比,HPLC-RID在成本和难度方面具有相对可访问性的其他优势。在后一点,故障排除LC-MS/MS方法在这里描述可能需要在质谱学的某种程度的专业知识。尽管如此,MS检测在RID上具有独特的吸引力,因为它可以进一步区分代谢体中标记的同位素,这是一种通过复杂的莱氨酸代谢网络18从补充基板理解碳运动的绝佳技术。此处应用了这种方法,通过补充 13C6葡萄糖的反应,并分析下游 13C 结合代谢物的相对丰度值。分析允许定义活性通路和非活动通路,支持先前报告的假设,并提供有关解析物代谢通量的新见解。也可以在具体分析的方法内进行修改。例如,可以与样品一起分析 13种 C 标记目标化合物的标准溶液,以便随着时间的推移实现葡萄糖衍生分子的绝对定量测量,并得出有关通量分布的结论。通过运行序列,调整为正模式检测,还可以在当前工作流中更好地检测带正电荷化合物。
两种方法的分析采样都方便自动化,确保高可重复性。此外,只要遵守适当的仪器处理做法和维护,就可以预期分析运行顺畅。在使用这些工具分析 CFME 反应时,应在采样的上游和下游做出更关键的考虑。在样品准备过程中,时间过程控制必须代表时间-零。在这里,蛋白质通过酸化沉淀在解质中,以阻止代谢反应。对于零时间样品,酸溶剂在加入含有葡萄糖的反应混合物之前与溶酶结合。与三氯乙酸化有效地确保葡萄糖不会在零时间代谢,如 HPLC-RID 数据(图 2)所示。虽然在报告的LC-MS/MS分析中进行了类似的淬火葡萄糖代谢程序,但在时间-零样品中检测到13个C标记代谢物,尽管与以后提取的样品相比,丰度值要低得多。此外,这些观察仅限于糖解中间体。数据表明,这些反应在酸化后保留了一定程度的糖溶剂活性,而提取溶剂是这种高度敏感的方法检测到的。然而,这一活动的程度应加以量化。先前的一项研究报告说,酸性萃取溶剂可能不足以淬火中间糖溶剂反应,但可以阻止大量的葡萄糖消耗10。虽然这还有待于在此使用的系统中进一步研究,但时间零和较晚时间点样本之间的相对丰度值的剧烈变化可以解释为葡萄糖代谢的趋势。然而,在类似的应用中,建议探索替代淬火方法,特别是获得绝对数量的代谢中间体10。此外,还应遵守下游软件分析过程中的良好做法。当手动集成来自 RID 信号的峰值区域以减少人为错误时,一致性至关重要。每当使用手动集成的峰值区域来量化样品中的代谢物浓度时,还应将手动集成应用于标准的峰值区域。在整个目标LC-MS/MS分析中,MZmine 分析的试探性注释应通过使用 MS 质量浏览器进行手动峰值检查来验证,并且 M/z 功能只有在计算的质量错误可以接受时才应注释。在这里,这些分析是手动执行为有限的一组目标,因为全面和强大的同位素搜索软件尚未确定。然而,这种搜索13C标签代谢物的自动化方法目前正在出现,并会简化更复杂的分析,如分析解析超越中央碳代谢25。
先进的液相色谱是分离复杂代谢混合物中小分子的一种坚固且广泛应用的方法。所述方法将此分离技术与折射指数或质谱检测相结合,以成功分析基于赖萨特的 CFME 反应中的代谢物转换。HPLC-RID 和 LC-MS/MS 是分析活性解析代谢的单独强大工具,可以进一步利用它们的互补性来解决每种技术的固有局限性。报告的方法使CFME的应用和发展,因为它们可以用来理解赖沙特代谢,监测有针对性的新陈代谢物转化的改进,并在操纵赖酸代谢时阐明新陈代谢通量的改变。
The authors have nothing to disclose.
这项研究由美国能源部基因组科学计划、科学、生物和环境研究办公室赞助,作为植物微生物界面科学重点区域(http://pmi.ornl.gov)的一部分。橡树岭国家实验室由美国能源部的UT-Battelle有限责任公司管理,合同合同为DE-AC05-00OR22725。这份手稿由美国能源部DE-AC05-00OR22725合同有限责任公司UT-Battelle撰写。美国政府保留和出版商通过接受该文章出版,承认美国政府保留一个非排他性的、有偿的、不可撤销的、全世界范围内出版或复制本手稿出版形式或允许其他人为美国政府目的出版或复制该手稿的许可证。能源部将根据能源部公共访问计划(http://energy.gov/downloads/doe-public-access-plan)为公众提供获得这些联邦赞助研究成果的机会。
0.22 μm centrifuge tube filters (spin columns) | Corning Costar | 8160 | |
1.5 mL microcentrifuge tubes | VWR | 87003-294 | |
1260 Infinity Binary LC Pump | Agilent | G1312B | HPLC-RID system |
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Formic acid (LC/MS grade) | Thermo Scientific | 85178 | Solvent preparation for LC-MS/MS |
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Glacial acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | S30 buffer ingredient |
Isopropanol (LC/MS grade) | Fisher Scientific | A461 | Solvent preparation for LC-MS/MS |
Kinetex 5 μm C18 stationary phase (100 Å) | Phenomenex | N/A; special order | Chromatography column for LC-MS/MS |
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OpenLab CDS (Online) Software | Agilent | Version 2.15.26 | Chromatography Data System for acquiring and analyzing HPLC data |
Orbitrap Velos Pro LTQ Tune Plus Software | Thermo | Version 2.7 | Software for tuning the LC-MS/MS system |
Potassium acetate | Sigma-Aldrich | P1190 | S30 buffer ingredient |
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Succinic acid | Sigma-Aldrich | 398055 | Dissolved in S30 buffer for standard curve solution preparation (HPLC-RID) |
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Trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6399 | |
Tris-acetate | GoldBio | T-090-100 | S30 buffer ingredient |
Ultimate 3000 LC with autosampler | Dionex | Solvent Rack: SRD-3600 | Liquid chromatography system for LC-MS/MS analysis |
Ultimate 3000 LC with autosampler | Dionex | Rapid Separation Binary Pump: HPG-3400RS | Liquid chromatography system for LC-MS/MS analysis |
Ultimate 3000 LC with autosampler | Dionex | Rapid Separation Well Plate Autosampler: WPS-3000TRS | Liquid chromatography system for LC-MS/MS analysis |
Water (LC/MS grade) | Fisher Scientific | W6500 | Solvent preparation for LC-MS/MS |
Xcalibur Software | Thermo | Version 3.0.63 | Data acquisition and interpretation software for LC-MS/MS |