我们演示了一种通过过滤牙菌斑和与宿主细菌共同培养来隔离新型细菌植物(糖化物)难以生长的成员的方法。
许多细菌物种不能在实验室中使用标准方法培养,这给研究地球上大多数微生物多样性造成了重大障碍。培养这些未培养的细菌需要新的方法,以便研究人员能够使用实验室中可用的强大工具有效地研究他们的生理和生活方式。候选菲拉辐射(CPR)是最大的未培养细菌群之一,占地球上生物多样性的15%。这个组的第一个分离体是糖化植物群的成员,即”纳米辛巴克特利库斯“菌株TM7x。 TM7x是一种异常小的细菌,它作为共生体与细菌宿主 夏利亚·奥东托利卡 直接接触,株XH001。利用异常小的细胞大小和它作为共生生物体的生活方式,我们开发了一个协议,从牙菌斑快速培养糖精。该协议将展示如何通过0.2μm过滤器过滤牙菌斑的悬浮,然后浓缩收集的糖精细胞,并感染宿主生物培养物。由此产生的共生可以通过任何正常的细菌培养和感染由PCR确认。由此产生的二元培养可以在实验室中保持,并用于未来的实验。虽然污染是有可能的,但可以通过进一步过滤和重新感染宿主,或电镀二元文化和对受感染的殖民地进行筛选来净化二元文化。我们希望此协议可以扩展到其他样本类型和环境,从而在 CPR 中培育出更多物种。
培育新品种的细菌并把它们带进实验室,可以进行强有力的实验,以更好地了解它们的生理和微生物群落内更广泛的相互作用。虽然有无文化的方法来询问这些问题(例如,”元经济学”),但不同微生物群的复杂相互作用使得很难区分单一变量并得出有意义的结论。虽然培养细菌有很多好处,但分离细菌并在纯文化中生长细菌存在许多潜在的障碍。潜在的特定生长要求包括pH、氧张力、维生素、生长因子、信号分子,甚至直接接触细胞以引起生长1。然而,人们认为,特定的辅助营养素是培养新细菌的主要威慑力量。标准介质配方缺乏未培养的细菌所需的许多营养物质,如特定的维生素或碳来源。这些缺失的分子可能是未培养细菌生理学的关键,通常由微生物群落中的另一个生物体或宿主生物体提供。例如,复杂的碳水化合物,如粘液,可以由动物宿主提供。将这些添加到媒体已经允许从动物肠道培养出一些细菌,包括阿克曼西亚粘液和穆奇尼沃兰斯希鲁迪尼斯2,3,4。许多致病细菌已经进化出在动物细胞中使用与海明结合的铁的能力,包括口服病原体波菲罗莫纳斯银杏5。在实验室中,生长的波菲罗莫纳斯和其他生物体,可以通过添加海敏6来刺激。
最近,在培育细菌新分离物方面取得了许多突破,通过联合培养,利用”喂食者”生物体为未培养的细菌提供生长所必需的特殊因素。Vartoukian及其同事的一项优雅研究表明,由细菌产生的铁结合分子侧马刺激了几种新型口腔分离物的生长。皮奥弗丁斯,一种由伪莫纳德物种产生的侧磷, 被证明显著促进一个新的 普雷沃泰拉 物种7的生长。在同一项研究中,培育了第一个用于叶绿素的口腔分离物,也使用 F.核 作为帮助者,提供一些未知化合物7。最近,一种来自 鲁米诺科卡塞 属的细菌被分离使用 细菌作为 帮助生物体8。后来发现,伽马氨基丁酸(GABA)是一种抑制性神经递质,需要在实验室介质上生长。事实证明,使用支线生物体是模仿未培养细菌生长的特定微环境的关键策略,比用不同浓度的不同添加剂不断重新调节生长介质更有效。
最大的未培养细菌群之一是在”候选菲拉辐射”(CPR),一个由几个候选细菌植物组成的单物理组9,10。截至本文撰写时,只有CPR内的糖精植物成员在实验室中成功培养。第一种分离物,’纳米辛巴克特裂解剂’菌株TM7x,是使用抗生素链霉素分离的,据预测,这种链霉素将丰富未培养的TM711,12。这项工作的一个关键发现是,新的分离物生长为一种寄生虫,生长在与细菌宿主沙利亚奥冬利卡的直接接触中,显微镜显示这些寄生虫是超小细菌。
利用这些线索,我们设计了一种方法,通过0.2μm过滤器过滤牙菌斑和其他口腔样本,通过离心收集过滤液中的细胞,并利用它们感染候选宿主细菌的培养物,从而迅速建立糖精的二元共生。这种方法具有避免富集培养的优点,因为富集文化可能被快速增长的生物所淹没。它还避免使用抗生素,这可能阻止目标糖精物种或其宿主的生长。利用这里演示的方法,我们成功地培养了32个分离出糖精植物。
我们过滤斑块并将其应用于宿主生物的纯种培养物的方法,主要基于早期对第一种培养糖精的观察,”纳米辛巴克特利蒂库斯”菌株TM7x 11、14、15。鉴于细胞体积小,我们推断它们可以使用过滤器与牙菌斑分离,并浓缩为离心。其次,由于这些生物体作为寄生虫生活,提供这些细胞纯正的宿主培养将允许它们进入共生并成长为二元文化。
这种方法的一个优点是,它不需要丰富文化或选择性的压力。”纳米细胞裂解剂” 菌株TM7x是从一种富集培养培养而来,使用链霉素作为选择性剂,测序表明,这种菌株对糖精的丰富是有效的。偶然的是,”纳米辛巴克特利蒂库斯”的主持人夏利亚·奥东托利蒂卡,已知对链霉素16具有抗药性。使用抗生素作为选择性剂也可以阻止宿主有机体生长,这反过来又会阻止糖精的生长。
使用浓缩培养物的一个更大的问题是,快速生长的生物体将迅速取代感兴趣的生物体。例如,在口腔中, 链球菌 物种可以快速生长,如果生长介质中含有糖分,则产生足够的酸来酸化介质,从而进一步选择与感兴趣的生物体对抗。通过避免富集培养和选择性抗生素,我们的方法提供了一个通用的方法,可以应用于更广泛的糖精和潜在的宿主没有这些其他方法的并发症。
此处介绍的方法存在一些障碍。首先,这种方法假定糖精生活在二元文化中。我们还没有测试三元或三元培养物的组合来衡量它们的有效性,但很可能有糖精需要生长因子,而单个宿主有机体无法提供这些生长因子。测试能够支持糖精生长的口腔细菌的巨大组合将是一项艰巨的任务。其次,该方法假定所有糖精都足够小,足以通过 0.2 μm 过滤器。可能是其他糖精比相信的要大,过滤器正在针对这些生物体进行选择。可以使用孔径较大的过滤器,但这有让更多不需要的口腔细菌进入受感染的共培养的风险。最后,在已经发表的物种之外很难找到宿主物种。到目前为止,唯一成功的宿主是来自类Actinomyces,沙利亚,阿拉奇尼亚和纤维素菌的物种,所有成员的植物actino细菌15,17,18。然而,这些主机只支持特定的糖精的发展。为了培养更多的糖精物种,必须探索更多的宿主。
我们希望这里介绍的方法将有助于未来对糖精和其他心肺复苏生物的研究。元基因组测序表明,这些生物体也有小基因组,被怀疑是共生体或依靠当地微生物群落来供应代谢物和其他对其生存至关重要的因素。类似的过滤策略可以用来隔离这些生物体,只要它们足够小,并且它们的宿主生物可以培养。这里描述的方法是将实验室培养的强大工具带到这个庞大而多样化的细菌群体的第一步。
The authors have nothing to disclose.
作者要感谢安妮·坦纳、布鲁斯·帕斯特、海克·博伊斯弗特、何雪松和巴特比勒格·博尔的有益讨论和提供细菌菌株。我们感谢苏珊·约斯特和杰西卡·伍兹的微生物技术援助。本出版物中报告的研究得到了国家卫生研究院国家牙科和颅面研究所的支持,奖励编号为R37 DE016937(FED)、R01 DE024468(FED)和T32 DE007327(AJC)。内容完全由作者负责,不一定代表国家卫生研究院的官方观点。
Agarose | Fisher Scientific | BP160-100 | |
Alphaimager | Cell Biosciences | FluorChem HD2 | Or equivalent UV gel imaging system |
Aluminum foil | Fisher Scientific | 01-213-101 | |
Brain Heart Infusion Broth (dehydrated powder) | Becton-Dickinson | 211059 | Or other growth media suitable for target organisms |
Centrifuge Rotor 70-Ti | Beckman Coulter | 337922 | |
Cryovials | Fisher Scientific | 12-567-500 | |
DMSO | Fisher Scientific | BP231-100 | |
Electrophoresis Power Supply | Bio-Rad | 1645052 | |
Electrophoresis Rig | Bio-Rad | 1704467 | |
Filter Forceps | Millipore Sigma | XX6200006P | Not essential, helps ensure filters are not punctured during handling |
Glycerol | Fisher Scientific | G33-500 | |
GoTaq Green Mastermix | Promega | M7122 | |
Mastercycler Pro Thermocycler | Eppendorf | 950040025 | Or equivalent thermocycler for PCR |
MgCl2 solution 25mM | Promega | A3513 | |
Molecular Biology grade water | Fisher Scientific | BP2819100 | |
O2 Control InVitro Glove Box | Coy Laoratories | 031615 | If needed for microaerobic organisms |
Optima L-100 XP High Speed Centrifuge | Beckman Coulter | 8043-30-1124 | |
P-10 micro pipette | Gilson | F144802 | |
P-1000 micro pipette | Gilson | F123601G | |
P-2 micro pipette | Gilson | F144801 | |
P-20 micro pipette | Gilson | F123600 | |
P-200 micro pipette | Gilson | F123602G | |
PBS | Fisher Scientific | BP399500 | |
PCR tubes 0.2 mL | Fisher Scientific | 14-230-205 | |
Peptone | Fisher Scientific | BP1420-500 | |
Pipette tips – 10 μL | Fisher Scientific | 02-717-157 | |
Pipette tips – 1000 μL | Fisher Scientific | 02-717-166 | |
Pipette tips – 20 μL | Fisher Scientific | 02-717-161 | |
Pipette tips – 200 μL | Fisher Scientific | 02-717-165 | |
Polycarbonate filters – 47mm, 0.2 μm pore size | Millipore | GTTP04700 | |
Screw-cap conical centrifuge tubes 15 mL | Falcon | 352096 | Or other tube suitable for bacterial culture |
Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
Swin-Lok Filter – 47mm | Whatman | 4200400 | |
SYBR Safe DNA Gel stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | |
Syringes – 20 mL | Fisher Scientific | 14-955-460 | |
TAE Buffer (50x) concentrate | Fisher Scientific | P1332500 | |
Thickwall Polycarbonate 25 x 89 mm (26.3mL capacity) centrifuge tubes with caps | Beckman Coulter | 355618 | |
Tryptic Soy Blood Agar Plates | Northeast Laboratory Services | P1100 | Or other agar plate sufficient for growth of host organisms |
Tryptic Soy Broth (dehydrated powder) | Becton-Dickinson | 211825 | Or other growth media suitable for target organisms |
Vinyl Anaerobic Chamber | Coy Laboratories | 032714 | If needed for anaerobic organisms |
Vortex mixer | Scientific Industries | SI-0236 | |
Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422-500 |