Establishing Stable Binary Cultures of Symbiotic Saccharibacteria from the Oral Cavity

Andrew J. Collins; Pallavi P. Murugkar; Floyd E. Dewhirst

doi:10.3791/62484

JoVE Journal > Biology

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Biyoloji

Establecimiento De Cultivos Binarios Estables De Saccharibacterias Simbióticas De La Cavidad Oral

Published: April 13, 2021

doi:

10.3791/62484

Andrew J. Collins*^1,2, Pallavi P. Murugkar*^1,2, Floyd E. Dewhirst^1,2

¹The Forsyth Institute, ²Harvard School of Dental Medicine

Özet

Se demuestra un método para aislar a los miembros difíciles de crecer del nuevo filo bacteriano, Saccharibacteria, mediante el filtrado de la placa dental y el co-cultivo con bacterias huésped.

Abstract

Muchas especies bacterianas no se pueden cultivar en el laboratorio utilizando métodos estándar, lo que representa una barrera significativa para el estudio de la mayoría de la diversidad microbiana en la tierra. Se requieren nuevos enfoques para cultivar estas bacterias incultas para que los investigadores puedan estudiar eficazmente su fisiología y estilo de vida utilizando las poderosas herramientas disponibles en el laboratorio. La radiación de profilaxis candidata (RCP) es uno de los grupos más grandes de bacterias no cultivadas, que comprende ~ 15% de la diversidad viva en la tierra. El primer aislado de este grupo fue un miembro del filo Saccharibacteria, ‘Nanosynbacter lyticus‘ cepa TM7x. TM7x es una bacteria inusualmente pequeña que vive como un simbionte en contacto directo con un huésped bacteriano, Schaalia odontolytica, cepa XH001. Aprovechando el tamaño de célula inusualmente pequeño y su forma de vida como organismo simbiótico, desarrollamos un protocolo para cultivar rápidamente Saccharibacteria de la placa dental. Este protocolo mostrará cómo filtrar una suspensión de placa dental a través de un filtro de 0,2 μm, luego concentrar las células de Saccharibacteria recolectadas e infectar un cultivo de organismos huéspedes. El cocultivo resultante puede ser aprobado como cualquier cultivo bacteriano normal y la infección se confirma por PCR. El cultivo binario resultante se puede mantener en el laboratorio y utilizar para futuros experimentos. Mientras que la contaminación es una posibilidad, la cultura binaria se puede purificar por la filtración y la reinfección adicionales del anfitrión, o por la galjanoplastia de la cultura binaria y la investigación para las colonias infectadas. Esperamos que este protocolo se pueda ampliar a otros tipos de muestras y ambientes, dando lugar al cultivo de muchas más especies en la RCP.

Introduction

Cultivar nuevas especies de bacterias y llevarlas al laboratorio permite experimentos poderosos para comprender mejor su fisiología y las interacciones más amplias dentro de su comunidad microbiana. Si bien existen métodos libres de cultura para interrogar estas preguntas (por ejemplo, “meta-ómicas”), las complejas interacciones de diversas poblaciones microbianas hacen que sea difícil separar variables individuales y llegar a conclusiones significativas. Si bien el cultivo de bacterias tiene muchos beneficios, hay muchas barreras potenciales para aislar una bacteria y cultivarla en cultivo puro. Los posibles requisitos específicos de crecimiento incluyen pH, tensión de oxígeno, vitaminas, factores de crecimiento, moléculas de señalización o incluso contacto celular directo para provocar el crecimiento¹. Sin embargo, se cree que las auxotrofias específicas son el principal elemento disuasorio para el cultivo de nuevas especies de bacterias. Las formulaciones de medios estándar carecen de muchos nutrientes requeridos por bacterias no cultivadas, como vitaminas específicas o fuentes de carbono. Estas moléculas faltantes pueden ser clave para la fisiología de las bacterias incultas y generalmente son proporcionadas por otro organismo en la comunidad microbiana o un organismo huésped. Por ejemplo, los carbohidratos complejos como las mucinas pueden ser proporcionados por huéspedes animales. La adición de estos a los medios de comunicación ha permitido el cultivo de varias bacterias de las tripas de los animales, incluyendo Akkermansia muciniphila y Mucinivorans hirudinis^2,^3,^4. Muchas bacterias patógenas han desarrollado la capacidad de utilizar hierro unido a la hemina en células animales, incluyendo el patógeno oral Porphyromonas gingivalis⁵. En el laboratorio, el crecimiento de Porphyromonas y otros organismos, puede ser estimulado por la adición de hemin⁶.

Recientemente, muchos avances en el cultivo de nuevos aislados de bacterias han llegado a través del co-cultivo, utilizando un organismo “alimentador” para proporcionar factores específicos a las bacterias no cultivadas necesarias para su crecimiento. Un estudio elegante de Vartoukian y de sus colegas mostró que los siderophores, moléculas obligatorias del hierro producidas por las bacterias, estimularon el crecimiento de varios aislantes orales nuevos. Se demostró que las pirodinas, un tipo de sideróforo producido por especies pseudomonadas, facilitan significativamente el crecimiento de una nueva especie de Prevotella ^7. En el mismo estudio, se cultivó el primer aislado oral para el filo Chloroflexi, utilizando también F. nucleatum como ayudante para proporcionar algún compuesto aún desconocido^7. Más recientemente, una bacteria del género Ruminococcaceae fue aislada usando Bacteroides fragilis como organismo ayudante⁸. Fue mostrado más adelante que el ácido aminobutírico gamma (GABA), un neurotransmisor inhibitorio, fue requerido para el crecimiento en medios de laboratorio. El uso de organismos alimentadores ha demostrado ser una estrategia clave para imitar microambientes específicos donde crecen bacterias no cultas, siendo más eficiente que reformular continuamente los medios de crecimiento con diferentes aditivos en diferentes concentraciones.

Uno de los grupos más grandes de bacterias no curativas se encuentran en la “Radiación filo candidata” (RCP), un grupo monofilético de varios filos bacterianos candidatos^9,^10. En el momento de escribir este artículo, sólo los miembros del filo Saccharibacteria dentro de la RCP se han cultivado con éxito en el laboratorio. El primer aislado, la cepa TM7xde ‘Nanosynbacter lyticus’, se aisló utilizando el antibiótico estreptomicina, que se había predicho que enriquecería para el inculto TM7^11,^12. Un descubrimiento clave de este trabajo fue que el nuevo aislado creció como un parásito que crecía en contacto directo con un huésped bacteriano, Schaalia odontolytica,y la microscopía mostró que estos parásitos eran bacterias ultras pequeñas.

Usando estas pistas, ideamos un método para establecer rápidamente cocultivos binarios de Saccharibacteria con sus socios filtrando la placa dental y otras muestras orales a través de un filtro de 0,2 μm, recogiendo células en el filtrado por centrifugación y usándolas para infectar cultivos de bacterias candidatas del huésped. Este método tiene la ventaja de evitar los cultivos de enriquecimiento, que pueden ser abrumados con organismos de rápido crecimiento. También evita el uso de antibióticos, que podrían detener el crecimiento de las especies de Saccharibacterias objetivo o de sus huéspedes. Usando el método demostrado aquí, hemos cultivado con éxito 32 aislantes del filo de Saccharibacteria.

Protocol

Al desarrollar este protocolo, se buscó y aprobó la aprobación del IRB (#14-10) y se obtuvo el consentimiento informado de todos los sujetos. 1. Preparación Cuando trabaje con sujetos humanos, obtenga la aprobación necesaria del IRB y el consentimiento informado. Comience los cultivos de bacterias huésped con tiempo suficiente para crecer a la fase estacionaria temprana. Por ejemplo, inocular 2-5 mL de caldo de soja tríptico con extracto de levadura al 0,1% añadido (TSBY) con Arachnia propionica e incubar a 37 °C durante 24 h. Ensamble portafiltros con una membrana de filtro de 0,2 μm grabada en orugas. Envuelva el conjunto en papel de aluminio y esterilice con autoclave. Esterifugar tubos de centrífuga y conjuntos de tapas. 2. Obtener una muestra de bacterias orales NOTA: Mientras que muchas muestras orales contienen Saccharibacteria (por ejemplo, saliva, hisopos de amígdalas, raspados de lengua) la placa dental es rutinariamente la más exitosa. Tome un raspado de placa usando un punto de papel estéril, curette Gracey, o, si se automuestreo, use un palillo de dientes estéril o una punta de pipeta. Transfiera la placa a un tampón adecuado, como diluyente de recuperación máxima (MRD, 0,85% NaCl, 0,1% peptona) o PBS. Si no se procesa inmediatamente, mantenga la muestra en hielo hasta que esté lista para continuar. Resuspend vigorosamente la placa dental en el almacenador intermediario de MRD usando una combinación de vortexing y de pipeteo con una pequeña punta de la pipeta. Agregue la muestra resuspended de la placa a 9 mL adicionales del almacenador intermediario de MRD. 3. Preparar el filtrado a partir de una muestra oral Usando la técnica aséptica, desenvuelva un conjunto de filtro estéril. Desenrosque un cuarto de vuelta y vuelva a apretar el soporte del filtro para asegurarse de que las roscas estén correctamente enganchadas y que el aparato esté cerrado correctamente. Usando una jeringa, lave la membrana pasando 10 ml de tampón MRD a través del aparato. El montaje incorrecto se revela en este paso por el fluido que se escapa del soporte del filtro. Si se produce una fuga, obtenga otro conjunto de filtro estéril y repita la etapa de lavado. Aplique la muestra al filtro lavado. Retire el émbolo de una jeringa y conédtelo al aparato filtrante. Vierta la muestra dental dispersa, ahora en 10 ml de tampón MRD, en una jeringa y cárguela en el filtro. Coloque un tubo de centrífuga estéril debajo del aparato de filtro para atrapar el filtrado, luego aplique presión de luz al émbolo para empujar la muestra a través del filtro. Repita el procedimiento con otros 10 mL de tampón MRD para lavar la membrana, recogiendo el flujo en el mismo tubo que la muestra filtrada. Asépticamente tapar el tubo. 4. Concentrar las células de Saccharibacteria por centrifugación Haga una marca de orientación en el tubo y la tapa y colóque el tubo en una centrífuga de alta velocidad con la marca en la parte superior. El pellet formado a partir de la centrifugación suele ser invisible. El marcado ayudará a determinar dónde se encuentra el pellet de células de Saccharibacteria cuando se realiza la centrifugación y se retira el tubo de la centrífuga. Centrifugar las muestras a 60.000 x g durante 1 h a 4 °C.NOTA: Esta fuerza y tiempo es suficiente para peletizar todas las células de Saccharibacteria. Sin embargo, las células de Saccharibacteria se pueden peletizar por lo menos parcialmente por centrifugación por tan poco como 20 minutos en 20.000 x g. Retire cuidadosamente los tubos de la centrífuga. Vierta el líquido del tubo, manteniendo el pellet en la parte superior del tubo. Resuspend la pelotilla generalmente invisible en 1-2 mL del almacenador intermediario de MRD por vortexing vigoroso. 5. Infecte los cultivos del huésped con filtrado enriquecido con sacaribacterias Prepare tubos de cultivo alícuotando 2 mL de medios de crecimiento apropiados (por ejemplo, TSBY, BHI, etc.) en tubos. Añadir 200 μL de cultivo nocturno de organismos huéspedes a cada tubo. Agregue 100-200 μL de muestra resuspended, filtrada a cada tubo. Incubar muestras combinadas según corresponda para el organismo huésped (por ejemplo, 37 °C, en una atmósfera aeróbica para A. propionica). Pase las células cada dos o tres días transfiriendo 200 μL de cultivo binario a 2 mL de medio de crecimiento fresco en un tubo nuevo. Si parece que las culturas pasajeras no muestran crecimiento (es decir, la turbidez / densidad óptica de la cultura no aumenta después del paso a medios frescos) las Saccharibacteria podrían ser abrumadoras o matar a todo el organismo huésped. Para remediar esto, agregue 200 μL de cultivo de huésped no infectado al pasar las células. Repetir durante al menos 5 pasajes. 6. Confirmar la infección por PCR Después de 5 pasajes, confirme la infección con PCR. Cinco pasajes asegurarán que cualquier célula de Saccharibacteria no creciente se haya agotado más allá del límite de detección utilizando 25 ciclos de PCR. Prepare un mastermix pcr. Una receta sugerida que se utiliza es la siguiente, para cada tubo necesario, preparar 12,5 μL 2x tampón de PCR, 0,75 μL 10 μM Imprimación directa (580F12 – AYT GGG CGT AAA GAG TTG C), 0,75 μL 10 μM Imprimación inversa (1177R13- GAC CTG ACA TCA TCC CCT CCT TCC), 1 μL 25 mM MgCl2 y 9 μL de agua. Mezclar por vórtice. Alícuota 24 μL de mastermix en un tubo de PCR de 0,2 mL. Añadir 1 μL de cultivo infectado con Sacaribacterias a la reacción de PCR. Coloque el tubo en un termociclador y realice el siguiente protocolo: Desnaturalización inicial 95 °C durante 5 min, 25 ciclos de 95 °C durante 30 s, 60 °C durante 30 s, 72 °C durante 30 s, elongación final a 72 °C durante 2 min, luego retención final a 4 °C. Cargue y ejecute los productos de PCR en un gel de agarosa al 1%. Una banda de ~ 600 bases indicará la presencia de Saccharibacteria. 7. Compruebe la pureza y elimine los organismos contaminantes Confirmar la pureza de los cultivos positivos mediante el revestimiento del cocultivo de Saccharibacterias en agar nutrientes suficientes para el crecimiento del organismo huésped. Realizar una dilución en serie de 10 veces del cultivo en tampón estéril (por ejemplo, MRD o PBS) y esparcir 100 μL en una placa de agar. Realizar diluciones tales que habrá aproximadamente 20-200 colonias creciendo en la placa de agar. Incubar el cultivo en condiciones de crecimiento adecuadas y observar si hay organismos contaminantes.NOTA: Las colonias de saccharibacterias haxénicas nunca se han observado, por lo que solo se observa el organismo huésped creciendo en estas placas. Más de un tipo de colonia generalmente indica contaminación. En caso de que se produzca contaminación, el cultivo debe volver a filtrarse para eliminar los contaminantes no deseados y volver a inocularse en el huésped fresco. Ocasionalmente se produce una doble infección, donde dos especies de Saccharibacteria infectan al mismo huésped. Para separar las especies de Saccharibacteria, resuspend colonias individuales en 20 μL de PBS estéril y utilizar 1 μL de suspensión en una reacción de PCR para detectar colonias con infecciones por Saccharibacteria. Transferir las suspensiones que dieron un resultado positivo al medio de crecimiento para iniciar una cultura binaria. La tasa de éxito dependerá del título de cada especie de Saccharibacteria en el cultivo. Puede ser necesario examinar más de 50 colonias para encontrar una infectada para su propagación. 8. Almacenamiento de cultivos Cultivar un cultivo binario de volumen suficiente (10-50 mL) durante la noche. Células pellet por centrifugación (4.000 x g durante 10 min).NOTA: La centrifugación de alta velocidad no es necesaria aquí, ya que las células de Saccharibacteria se unirán a las células más grandes y pesadas del huésped y se peletizarán con ellas. Células resuspend en cryoprotectant. Los medios de crecimiento complementados con DMSO del 5% o el glicerol del 20% son generalmente suficientes. Asegúrese de que el organismo huésped es compatible con medios crioprotectores (por ejemplo, el crecimiento de A. propionica es inhibido por el glicerol y las existencias congeladas pueden no revivir). Probar la viabilidad de un cultivo huésped no infectado con crioprotector para garantizar que las poblaciones puedan sobrevivir a la congelación. Pellet de células resuspender en el mismo volumen de cultivo (10-50 mL). Alícuota 0,5 mL en crioviales marcados. Congelar cultivos celulares a -80 °C.

Representative Results

La PCR para la detección de Saccharibacteria puede aparecer negativa (es decir, ningún producto visto) en las culturas iniciales de la infección debido a un número bajo de simbiontes de Saccharibacteria. Sin embargo, después de algunos pasajes debe aparecer un producto de PCR fuerte que muestre que se ha producido una infección estable (Figura 1A). Por el contrario, algunas infecciones inicialmente aparecerán positivas por PCR, pero disminuirán a indetectables después de 1-4 pasajes (no se muestran). Esto indica que una gran cantidad de células de Saccharibacteria estaban presentes en el filtrado inicial, pero se diluyeron por el paso y ninguno fue capaz de entrar en una simbiosis estable con el cultivo del huésped. El ensayo de varias especies huésped con el mismo filtrado de Saccharibacteria de la cavidad oral suele tener una baja tasa de éxito(Figura 1B)ya que la interacción simbionte-huésped es muy específica. Un investigador también puede probar el mismo huésped con filtrados de varios sujetos diferentes. Si se utiliza un buen organismo huésped (como Arachnia propionica o Schaalia odontolytica),se puede esperar una tasa de éxito del 50%. Las pruebas por PCR son cruciales. Investigadores experimentados han intentado confirmar la infección por microscopía, solo para reportar falsos positivos. Las células de Saccharibacteria son pequeñas y difíciles de distinguir entre vesículas o protuberancias irregulares de la envoltura celular. Una señal de PCR estable a través de varios pasajes es clave para confirmar una infección exitosa. A medida que los cultivos infectados crecen, debe aparecer un crecimiento turbio normal. A medida que la simbiosis se establece, los cultivos infectados aparecerán menos turbios que los cultivos de organismos huéspedes no infectados (Figura 2A). En algunos casos, los cultivos infectados pueden parecer que dejan de crecer por completo y no se vuelven turbios en absoluto. Esto puede ser debido a una infección donde las células de Saccharibacteria están abrumando el organismo huésped. La adición de huésped “fresco” (no infectado) a estos cultivos debe proporcionar una población suficiente de huésped para apoyar el crecimiento continuo de los parásitos Saccharibacteria. El crecimiento excesivo, o cultivos excesivamente turbios, puede indicar contaminación por un contaminante de laboratorio u otra pequeña bacteria oral que pudo pasar a través del filtro de 0,2 μm. Campylobacter y Capnocytophaga spp. Esto se puede confirmar enchapando el cultivo y buscando colonias que sean atípicas del organismo huésped seguidas de la secuenciación del ARNr 16S. Si se observa contaminación, el filtrado de estos cultivos a través de un filtro de 0,2 μm suele ser suficiente para eliminar los contaminantes. Las células de saccharibacterias en el filtrado pueden ser concentradas por centrifugación y utilizadas para rein infectar un cultivo de huésped puro. Otra forma de purificar un cultivo contaminado es recogiendo colonias infectadas de la galjanoplastia de un cultivo infectado. Las colonias de huéspedes infectados a veces se pueden identificar por la forma irregular de la colonia en comparación con las colonias no infectadas (Figura 2B-D). Estas colonias irregulares dependen del título de Saccharibacteria en el cultivo binario y una menor proporción de colonias aparecerá irregular si el título es bajo. Esto puede facilitar la identificación de colonias infectadas, que pueden ser recogidas y utilizadas para iniciar un cultivo binario puro. Si no se ven colonias irregulares en el revestimiento de un cultivo infectado por Saccharibacteria, es posible que el simbionte esté en un título bajo o no cause colonias de forma irregular. En tal caso, las colonias de cribado por PCR con una apariencia normal pueden mostrar infección por Saccharibacteria, pero a una tasa baja (2-10% de todas las colonias). Figura 1: Resultados típicos de PCR de infecciones por Saccharibacteria de cultivos hospedantes. (A)Un producto de PCR que indica la presencia de Saccharibacteria puede no aparecer con la infección inicial, pero puede aparecer y fortalecerse en pasajes posteriores a medida que el cocultivo se establece. (B)La mayoría de los huéspedes infectados con filtrado enriquecido con Saccharibacteria no apoyarán su crecimiento debido a la especificidad de la simbiosis. En este ejemplo, sólo A. propionica se infectó con éxito. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura. Figura 2:Características de crecimiento de los cultivos infectados con Saccharibacteria. (A)Las curvas de crecimiento de los cultivos infectados y no infectados de A. propionica que muestran un cultivo infectado no crecerán a la misma densidad que el control no infectado y aparecerán menos turbias. (B -D) El revestimiento de cocultivos puede producir colonias irregulares, causadas por infecciones por saccharibateria. Las colonias irregulares disminuirán en proporción en relación con el título de Saccharibacteria en el cocultivo. (B)Huésped con un alto nivel de Sacaribacterias. (C) 10 veces diluido Saccharibacteria (D) Cultivo de huésped no infectado. Las flechas blancas indican ejemplos de colonias irregulares. Barra de escala = 1 cm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Nuestro método de filtrar la placa y aplicarla a cultivos puros de organismos huéspedes se basa en gran medida en observaciones anteriores sobre las primeras Saccharibacteria cultivadas, la cepa TM7x^11,^14,¹⁵de Nanosynbacter lyticus. Dado el pequeño tamaño de la célula, deducimos que podrían ser separados de la placa dental usando un filtro y concentrados con la centrifugación. En segundo lugar, como estos organismos viven como parásitos, proporcionar a estas células cultivos puros de huéspedes les permitiría entrar en una simbiosis y crecer como cultivos binarios.

Una ventaja de este método es que no requiere un cultivo de enriquecimiento o presión selectiva. La cepa TM7xde ‘Nanosynbacter lyticus’ se cultuó a partir de un cultivo de enriquecimiento utilizando estreptomicina como agente selectivo, cuya secuenciación había sugerido que sería eficaz para enriquecer para Saccharibacteria. Fortuitamente, el huésped de‘Nanosynbacter lyticus’ Schaalia odontolytica, se sabe que es resistente a la estreptomicina¹⁶. El uso de antibióticos como agente selectivo también podría evitar que el organismo huésped crezca, lo que a su vez impediría el crecimiento de Saccharibacteria.

Un problema más grande del uso de cultivos de enriquecimiento es que los organismos de rápido crecimiento desplazarán rápidamente a los organismos de interés. En la cavidad oral, por ejemplo, las especies de Streptococcus pueden crecer rápidamente y, si el azúcar está presente en el medio de crecimiento, producir suficiente ácido para acidificar el medio, seleccionando aún más contra los organismos de interés. Al evitar un cultivo de enriquecimiento y antibióticos selectivos, nuestro método proporciona un enfoque general que podría aplicarse a una gama más amplia de saccharibacterias y huéspedes potenciales sin las complicaciones de estos otros métodos.

Hay algunos obstáculos para el método presentado aquí. En primer lugar, este método asume que saccharibacterias viven en un cultivo binario. No hemos probado combinaciones de cultivos triarios o ternarios para medir su eficacia, pero es probable que haya Sacaribacterias que requieran factores de crecimiento que un solo organismo huésped no puede suministrar. Probar las vastas combinaciones de bacterias orales que podrían apoyar el crecimiento de saccharibacterias sería una tarea desalentadora. En segundo lugar, el método asume que todas las Saccharibacteria son lo suficientemente pequeñas como para pasar a través de un filtro de 0,2 μm. Podría ser que otras Saccharibacteria son más grandes de lo que se cree y el filtro está seleccionando contra estos organismos. Se podría utilizar un filtro con un tamaño de poro más grande, pero esto corre el riesgo de permitir que más bacterias orales no deseadas entren en el co-cultivo infectado. Por último, es muy difícil encontrar especies huésped fuera de las que ya se han publicado. Hasta el momento, los únicos huéspedes exitosos son especies de los géneros Actinomyces, Schaalia, Arachnia y Cellulosimicrobium,todos miembros del filo Actinobacteria^15,^17,^18. Sin embargo, estos huéspedes sólo apoyan el crecimiento de saccharibacterias específicas. Para cultivar más especies de Saccharibacteria, se deben explorar muchos más huéspedes.

Esperamos que el método presentado aquí ayudará a la investigación futura de las sacaribacterias y otros organismos de RCP. La secuenciación metagenómica sugiere que estos organismos también tienen genomas pequeños y se sospecha que son simbiontes o dependen de la comunidad microbiana local para suministrar metabolitos y otros factores críticos para su supervivencia¹⁹. Se podría utilizar una estrategia de filtrado similar para aislar estos organismos, siempre que sean lo suficientemente pequeños y que sus organismos huéspedes puedan ser cultivados. Los métodos descritos aquí son un primer paso para llevar las poderosas herramientas del cultivo de laboratorio a este grupo grande y diverso de bacterias.

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores desean agradecer a Anne Tanner, Bruce Paster, Heike Boisvert, Xuesong He y Batbileg Bor por sus útiles discusiones y por proporcionar cepas bacterianas. Agradecemos a Susan Yost y Jessica Woods por la asistencia técnica microbiana. La investigación reportada en esta publicación fue apoyada por el Instituto Nacional de Investigación Dental y Craneofacial de los Institutos Nacionales de Salud bajo los números de premio R37 DE016937 (FED), R01 DE024468 (FED) y T32 DE007327 (AJC). El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales de los Institutos Nacionales de Salud.

Materials

Agarose	Fisher Scientific	BP160-100
Alphaimager	Cell Biosciences	FluorChem HD2	Or equivalent UV gel imaging system
Aluminum foil	Fisher Scientific	01-213-101
Brain Heart Infusion Broth (dehydrated powder)	Becton-Dickinson	211059	Or other growth media suitable for target organisms
Centrifuge Rotor 70-Ti	Beckman Coulter	337922
Cryovials	Fisher Scientific	12-567-500
DMSO	Fisher Scientific	BP231-100
Electrophoresis Power Supply	Bio-Rad	1645052
Electrophoresis Rig	Bio-Rad	1704467
Filter Forceps	Millipore Sigma	XX6200006P	Not essential, helps ensure filters are not punctured during handling
Glycerol	Fisher Scientific	G33-500
GoTaq Green Mastermix	Promega	M7122
Mastercycler Pro Thermocycler	Eppendorf	950040025	Or equivalent thermocycler for PCR
MgCl2 solution 25mM	Promega	A3513
Molecular Biology grade water	Fisher Scientific	BP2819100
O2 Control InVitro Glove Box	Coy Laoratories	031615	If needed for microaerobic organisms
Optima L-100 XP High Speed Centrifuge	Beckman Coulter	8043-30-1124
P-10 micro pipette	Gilson	F144802
P-1000 micro pipette	Gilson	F123601G
P-2 micro pipette	Gilson	F144801
P-20 micro pipette	Gilson	F123600
P-200 micro pipette	Gilson	F123602G
PBS	Fisher Scientific	BP399500
PCR tubes 0.2 mL	Fisher Scientific	14-230-205
Peptone	Fisher Scientific	BP1420-500
Pipette tips – 10 μL	Fisher Scientific	02-717-157
Pipette tips – 1000 μL	Fisher Scientific	02-717-166
Pipette tips – 20 μL	Fisher Scientific	02-717-161
Pipette tips – 200 μL	Fisher Scientific	02-717-165
Polycarbonate filters – 47mm, 0.2 μm pore size	Millipore	GTTP04700
Screw-cap conical centrifuge tubes 15 mL	Falcon	352096	Or other tube suitable for bacterial culture
Sodium chloride	Fisher Scientific	BP358-1
Swin-Lok Filter – 47mm	Whatman	4200400
SYBR Safe DNA Gel stain	ThermoFisher Scientific	S33102
Syringes – 20 mL	Fisher Scientific	14-955-460
TAE Buffer (50x) concentrate	Fisher Scientific	P1332500
Thickwall Polycarbonate 25 x 89 mm (26.3mL capacity) centrifuge tubes with caps	Beckman Coulter	355618
Tryptic Soy Blood Agar Plates	Northeast Laboratory Services	P1100	Or other agar plate sufficient for growth of host organisms
Tryptic Soy Broth (dehydrated powder)	Becton-Dickinson	211825	Or other growth media suitable for target organisms
Vinyl Anaerobic Chamber	Coy Laboratories	032714	If needed for anaerobic organisms
Vortex mixer	Scientific Industries	SI-0236
Yeast Extract	Fisher Scientific	BP1422-500

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Saccharibacteria Oral Cavity Binary Co-culture Obligate Parasites Host Bacteria Arachnia Propionica Dental Plaque Filtration Isolation Microbiological Techniques

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Collins, A. J., Murugkar, P. P., Dewhirst, F. E. Establishing Stable Binary Cultures of Symbiotic Saccharibacteria from the Oral Cavity. J. Vis. Exp. (170), e62484, doi:10.3791/62484 (2021).