Описано применение свиной роговицы для проверки противовирусной эффективности экспериментальных препаратов.
Вирусы и бактерии могут вызывать различные дефекты поверхности глаз и дегенерацию, такие как раны и язвы, через инфекцию роговицы. С серораспространенностью, которая колеблется от 60-90% во всем мире, вирус простого герпеса типа 1 (ВПГ-1) обычно вызывает слизисто-кожные поражения орофациальной области, которые также проявляются как поражения и связанная с инфекцией слепота. Хотя современные противовирусные препараты эффективны, появление резистентности и сохранение токсичных побочных эффектов требует разработки новых противовирусных препаратов против этого вездесущего патогена. Хотя оценка in vitro предоставляет некоторые функциональные данные относительно появляющегося противовирусного препарата, они не демонстрируют сложность глазной ткани in vivo. Однако исследования in vivo стоят дорого и требуют обученного персонала, особенно при работе с вирусными агентами. Следовательно, модели ex vivo являются эффективными, но недорогими шагами для противовирусного тестирования. Здесь мы обсуждаем протокол изучения инфекции ВПГ-1 с использованием роговиц свиней ex vivo и метод их местного лечения с использованием существующих и новых противовирусных препаратов. Мы также демонстрируем метод проведения анализа бляшек с использованием ВПГ-1. Подробные методы могут быть использованы для проведения аналогичных экспериментов по изучению инфекций, которые напоминают возбудителя ВПГ-1.
Люди, страдающие глазными инфекциями, часто страдают от потеризрения 1. С высокой серораспространенностью во всем мире инфицированные ВПГ лица страдают от повторяющихся глазных инфекций, которые приводят к рубцеванию роговицы, стромальному кератиту и неоваскуляризации2,3,4,5. Инфекции ВПГ также показали, что вызывают реже ряд серьезных состояний среди пациентов с ослабленным иммунитетом, нелеченных пациентов, таких как энцефалит и системная заболеваемость6,7,8. Такие препараты, как Ацикловир (ЯЦВ) и его аналоги нуклеозидов, показали последовательный успех в сдерживании инфекции ВПГ-1 и даже контроле реактивации, однако длительное использование этих препаратов связано с почечной недостаточностью, аномалиями плода и неспособностью ограничить появление лекарственной устойчивости к развивающимся вирусным штаммам9,10,11,12,13. Сложности, связанные с глазными инфекциями ВПГ-1, ранее изучались in vitro с использованием монослоев и 3D-культур клеток роговицы человека и in vivo с использованием мышиных или кроличьих глазных инфекций. Хотя эти модели in vitro предоставляют значительные данные о клеточных биологических компонентах инфекций ВПГ-1, они, однако, не могут имитировать сложную сложность ткани роговицы и мало что делают для освещения дендритного распространения вируса14. Напротив, хотя системы in vivo более проницательны в демонстрации распространения инфекции в роговице и реакций иммунной активации во время инфекции ВПГ-1, они приходят с оговоркой, что им требуются обученные исследователи и большие учреждения по уходу за животными, чтобы игнорировать эксперименты.
Здесь мы используем роговицу свиней в качестве модели ex vivo для изучения раневой системы, вызванной инфекцией ВПГ-1. Как потенциальная фармакология некоторых лекарств, так и клеточная и молекулярная биология раневой системы, вызванной инфекцией, могут быть изучены с помощью тканевых эксплантных культур. Эта модель также может быть изменена для использования при других вирусных и бактериальных инфекциях. В этом исследовании роговицы свиней использовались для проверки противовирусной эффективности доклинической малой молекулы BX795. Использование роговиц свиней было предпочтительным из-за простоты доступа и экономической эффективности. Кроме того, модели роговицы свиней являются хорошими моделями человеческих глаз, причем роговицы легко изолируются, имеют адекватный размер для инфекции и визуализации и надежны для обработки15. Роговицы свиней также сопоставимы со сложностью моделей роговицы человека как по транспроницаемости роговицы, так и по системной абсорбции15. Используя эту модель для исследования, мы смогли выяснить, как BX795 заслуживает дальнейшего изучения в качестве компетентного ингибитора вирусной инфекции ВПГ-1 и добавить к литературе классификацию его как потенциального маломолекулярного противовирусного соединения16.
Предыдущие исследования показали, что BX795 играет многообещающую роль в качестве противовирусного средства против инфекции ВПГ-1; путем ингибирования TANK-связывающей киназы 1 (TBK1)16. Как TBK1, так и аутофагия сыграли определенную роль в ингибировании инфекции ВПГ-1, как показано ?…
The authors have nothing to disclose.
Это исследование было поддержано грантами NIH (R01 EY024710, RO1 AI139768 и RO1 EY029426) для D.S. A.A. было поддержано грантом F30EY025981 от Национального института глаз, NIH. Исследование проводилось с использованием роговицы свиней, полученной от компании Park Packing, 4107 Ashland Avenue, New City, Chicago, IL-60609
30 G hypodermic needles. | BD | 305128 | |
500 mL glass bottle. | Thomas Scientific | 844027 | |
Antimycotic and Antibiotic (AA) | GIBCO | 15240096 | Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use |
Benchtop vortexer. | BioDot | BDVM-3200 | |
Biosafety cabinet with a Bio-Safety Level-2 (BSL-2) certification. | Thermofisher Scientific | Herasafe 2030i | |
Calgiswab 6" Sterile Calcium Alginate Standard Swabs. | Puritan | 22029501 | |
Cell scraper – 25 cm | Biologix BE | 70-1180 70-1250 | |
Crystal violet | Sigma Aldrich | C6158 | Store the powder in a dark place |
Dulbecco’s modified Eagle’s medium – DMEM | GIBCO | 41966029 | Store at 4 °C until use |
Ethanol | Sigma Aldrich | E7023 | |
Fetal bovine serum -FBS | Sigma Aldrich | F2442 | Aliquot into 50 mL tubes and keep frozen until use |
Flat edged tweezers – 2. | Harward Instruments | 72-8595 | |
Freezers –80 °C. – | Thermofisher Scientific | 13 100 790 | |
Fresh box of blades. | Thomas Scientific | TE05091 | |
Guaze | Johnson & Johnson | 108 square inch folder 12 ply | |
HSV-1 17GFP | grown in house | – | Original strain from Dr. Patricia Spears, Northwestern University. GFP expressing HSV-1 strain 17 |
Insulin, Transferrin, Selenium – ITS | GIBCO | 41400045 | Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use |
Magnetic stirrer. | Thomas Scientific | H3710-HS | |
Metallic Scissors. | Harward Instruments | 72-8400 | |
Micropipettes 1 to 1000 µL. | Thomas Scientific | 1159M37 | |
Minimum Essential Medium – MEM | GIBCO | 11095080 | Store at 4 °C until use |
OptiMEM | GIBCO | 31985047 | Store at 4 °C until use |
Penicillin/streptomycin. | GIBCO | 15140148 | Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use |
Phosphate Buffer Saline -PBS | GIBCO | 10010072 | Store at room temperature |
Porcine Corneas | Park Packaging Co., Chicago, IL | 0 | Special order by request |
Procedure bench covers – as needed. | Thermofisher Scientific | S42400 | |
Serological Pipettes | Thomas Scientific | P7132, P7127, P7128, P7129, P7137 | |
Serological Pipetting equipment. | Thomas Scientific | Ezpette Pro | |
Stereoscope | Carl Zeiss | SteREO Discovery V20 | |
Stirring magnet. | Thomas Scientific | F37120 | |
Tissue culture flasks, T175 cm2. | Thomas Scientific | T1275 | |
Tissue culture incubators which can maintain 5% CO2 and 37 °C temperature. | Thermofisher Scientific | Forma 50145523 | |
Tissue culture treated plates (6-well). | Thomas Scientific | T1006 | |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | GIBCO | 25-300-062 | Aliquot into 10 mL tubes and keep frozen until use |
Vero cells | American Type Culture Collection ATCC | CRL-1586 |