Wir beschreiben die Verwendung einer Schweinehornhaut, um die antivirale Wirksamkeit experimenteller Medikamente zu testen.
Viren und Bakterien können eine Vielzahl von Augenoberflächendefekten und Degenerationen wie Wunden und Geschwüre durch Hornhautinfektionen verursachen. Mit einer Seroprävalenz, die weltweit zwischen 60 und 90% liegt, verursacht das Herpes-Simplex-Virus Typ-1 (HSV-1) häufig mukokutane Läsionen der orofazialen Region, die sich auch als Läsionen und infektionsbedingte Blindheit manifestieren. Während aktuelle antivirale Medikamente wirksam sind, erfordert das Auftreten von Resistenzen und die Persistenz toxischer Nebenwirkungen die Entwicklung neuartiger antiviraler Medikamente gegen diesen allgegenwärtigen Erreger. Obwohl die In-vitro-Bewertung einige funktionelle Daten zu einem aufkommenden antiviralen Mittel liefert, zeigen sie nicht die Komplexität des Augengewebes in vivo. In-vivo-Studien sind jedoch teuer und erfordern geschultes Personal, insbesondere bei der Arbeit mit viralen Wirkstoffen. Daher sind Ex-vivo-Modelle effiziente und dennoch kostengünstige Schritte für antivirale Tests. Hier diskutieren wir ein Protokoll zur Untersuchung der Infektion mit HSV-1 unter Verwendung von Schweinehornhäuten ex vivo und eine Methode, um sie topisch mit bestehenden und neuartigen antiviralen Medikamenten zu behandeln. Wir demonstrieren auch die Methode zur Durchführung eines Plaque-Assays mit HSV-1. Die detaillierten Methoden können verwendet werden, um ähnliche Experimente durchzuführen, um Infektionen zu untersuchen, die dem HSV-1-Erreger ähneln.
Menschen, die an Augeninfektionen leiden, erleiden häufig Sehverlust1. Mit einer weltweit hohen Seroprävalenz leiden HSV-infizierte Personen an wiederkehrenden Augeninfektionen, die zu Hornhautvernarbungen, Stromakeratitis und Neovaskularisation führen2,3,4,5. HSV-Infektionen haben auch gezeigt, dass sie weniger häufig eine Reihe von schweren Erkrankungen bei immungeschwächten, unbehandelten Patienten wie Enzephalitis und systemische Morbidität verursachen6,7,8. Medikamente wie Aciclovir (ACV) und seine Nukleosidanaloga haben einen konsistenten Erfolg bei der Eindämmung der HSV-1-Infektion und sogar der Kontrolle der Reaktivierung gezeigt, aber der längere Gebrauch dieser Medikamente ist mit Nierenversagen, fetalen Anomalien und dem Versagen verbunden, die Entstehung von Arzneimittelresistenzen gegen sich entwickelnde Virusstämme einzuschränken9,10,11,12,13. Komplexitäten im Zusammenhang mit HSV-1-Augeninfektionen wurden zuvor in vitro mit Monoschichten und 3D-Kulturen menschlicher Hornhautzellen und in vivo mit murinen oder Kaninchen-Augeninfektionen untersucht. Während diese In-vitro-Modelle signifikante Daten über die zellbiologischen Komponenten von HSV-1-Infektionen liefern, können sie jedoch die komplizierte Komplexität des Hornhautgewebes nicht nachahmen und tun wenig, um die dendritische Ausbreitung des Virus zubeleuchten 14. Im Gegensatz dazu, obwohl In-vivo-Systeme aufschlussreicher sind, um die Ausbreitung von Infektionen in Hornhäuten und Immunaktivierungsreaktionen während der HSV-1-Infektion zu zeigen, haben sie den Vorbehalt, dass sie geschulte Ermittler und große Einrichtungen für die Tierpflege benötigen, um die Experimente zu übersehen.
Hier verwenden wir Schweinehornhäute als Ex-vivo-Modell, um das HSV-1-infektionsinduzierte Wundsystem zu untersuchen. Sowohl die potenzielle Pharmakologie bestimmter Medikamente als auch die Zell- und Molekularbiologie des durch die Infektion verursachten Wundsystems können durch Gewebeentsteigungskulturen untersucht werden. Dieses Modell kann auch für die Verwendung bei anderen viralen und bakteriellen Infektionen geändert werden. In dieser Studie wurden Schweinehornhäute verwendet, um die antivirale Wirksamkeit eines präklinischen kleinen Moleküls, BX795, zu testen. Die Verwendung von Schweinehornhäuten wurde aufgrund des einfachen Zugangs und der Kosteneffizienz bevorzugt. Darüber hinaus sind Schweinehornhautmodelle gute Modelle der menschlichen Augen, wobei die Hornhäute leicht zu isolieren sind, ausreichend für Infektionen und Visualisierungen dimensioniert und robust sind, um15zu handhaben. Schweinehornhäute sind auch vergleichbar mit der Komplexität menschlicher Hornhautmodelle sowohl in der transkornealen Permeabilität als auch in der systemischen Absorption15. Durch die Verwendung dieses Modells für die Studie konnten wir aufklären, wie BX795 als kompetenter Inhibitor der HSV-1-Virusinfektion einer weiteren Untersuchung würdig ist und die Literatur zur Klassifizierung als potenzielle niedermolekulare antivirale Verbindungergänzt 16.
Frühere Forschungen haben gezeigt, dass BX795 eine vielversprechende Rolle als antivirales Mittel gegen HSV-1-Infektionen spielt. durch Hemmung der TANK-bindenden Kinase 1 (TBK1)16. Sowohl TBK1 als auch Autophagie haben eine Rolle bei der Hemmung der HSV-1-Infektion gespielt, wie sie an menschlichen Hornhautepithelzellen gezeigt wurde. BX795 erwies sich als maximal wirksam bei antiviraler Aktivität in einer Konzentration von 10μM und sowohl unter Verwendung der Western-Blot-Analyse als auch der…
The authors have nothing to disclose.
Diese Studie wurde durch NIH-Zuschüsse (R01 EY024710, RO1 AI139768 und RO1 EY029426) an D.S. A.A. unterstützt, die durch einen F30EY025981-Zuschuss des National Eye Institute, NIH, unterstützt wurden. Die Studie wurde mit den Schweinehornhäuten der Park Packing Company, 4107 Ashland Avenue, New City, Chicago, IL-60609, durchgeführt.
30 G hypodermic needles. | BD | 305128 | |
500 mL glass bottle. | Thomas Scientific | 844027 | |
Antimycotic and Antibiotic (AA) | GIBCO | 15240096 | Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use |
Benchtop vortexer. | BioDot | BDVM-3200 | |
Biosafety cabinet with a Bio-Safety Level-2 (BSL-2) certification. | Thermofisher Scientific | Herasafe 2030i | |
Calgiswab 6" Sterile Calcium Alginate Standard Swabs. | Puritan | 22029501 | |
Cell scraper – 25 cm | Biologix BE | 70-1180 70-1250 | |
Crystal violet | Sigma Aldrich | C6158 | Store the powder in a dark place |
Dulbecco’s modified Eagle’s medium – DMEM | GIBCO | 41966029 | Store at 4 °C until use |
Ethanol | Sigma Aldrich | E7023 | |
Fetal bovine serum -FBS | Sigma Aldrich | F2442 | Aliquot into 50 mL tubes and keep frozen until use |
Flat edged tweezers – 2. | Harward Instruments | 72-8595 | |
Freezers –80 °C. – | Thermofisher Scientific | 13 100 790 | |
Fresh box of blades. | Thomas Scientific | TE05091 | |
Guaze | Johnson & Johnson | 108 square inch folder 12 ply | |
HSV-1 17GFP | grown in house | – | Original strain from Dr. Patricia Spears, Northwestern University. GFP expressing HSV-1 strain 17 |
Insulin, Transferrin, Selenium – ITS | GIBCO | 41400045 | Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use |
Magnetic stirrer. | Thomas Scientific | H3710-HS | |
Metallic Scissors. | Harward Instruments | 72-8400 | |
Micropipettes 1 to 1000 µL. | Thomas Scientific | 1159M37 | |
Minimum Essential Medium – MEM | GIBCO | 11095080 | Store at 4 °C until use |
OptiMEM | GIBCO | 31985047 | Store at 4 °C until use |
Penicillin/streptomycin. | GIBCO | 15140148 | Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use |
Phosphate Buffer Saline -PBS | GIBCO | 10010072 | Store at room temperature |
Porcine Corneas | Park Packaging Co., Chicago, IL | 0 | Special order by request |
Procedure bench covers – as needed. | Thermofisher Scientific | S42400 | |
Serological Pipettes | Thomas Scientific | P7132, P7127, P7128, P7129, P7137 | |
Serological Pipetting equipment. | Thomas Scientific | Ezpette Pro | |
Stereoscope | Carl Zeiss | SteREO Discovery V20 | |
Stirring magnet. | Thomas Scientific | F37120 | |
Tissue culture flasks, T175 cm2. | Thomas Scientific | T1275 | |
Tissue culture incubators which can maintain 5% CO2 and 37 °C temperature. | Thermofisher Scientific | Forma 50145523 | |
Tissue culture treated plates (6-well). | Thomas Scientific | T1006 | |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | GIBCO | 25-300-062 | Aliquot into 10 mL tubes and keep frozen until use |
Vero cells | American Type Culture Collection ATCC | CRL-1586 |