Imersão alternativa em glicose para produzir hiperglicemia prolongada em zebrafish

Os zebrafish (Danio rerio) estão rapidamente se tornando um modelo animal amplamente utilizado para estudar tanto a doença quanto a cognição¹. A facilidade da manipulação genética e da transparência embrionária através dos estágios iniciais do desenvolvimento, fazem deles um dos principais candidatos a estudar doenças humanas com uma base genética conhecida. Por exemplo, os zebrafish têm sido usados para estudar síndrome de Holt-Oram, cardiomiopatias, doença renal glomerulocástica, distrofia muscular e diabetes mellitus (DM) entre outras doenças¹. Além disso, o modelo de zebrafish é ideal por causa do pequeno tamanho da espécie, facilidade de manutenção e alta fecundidade^2,3.

O pâncreas de zebrafish é anatomicamente e funcionalmente semelhante ao pâncreas^{mamífero 4}. Assim, as características únicas de tamanho, alta fecundidade e estruturas endócrinas semelhantes fazem do zebrafish um candidato adequado para estudar complicações relacionadas ao DM. No zebrafish, existem dois métodos experimentais usados para induzir a hiperglicemia prolongada que é característica do DM: um influxo de glicose (modelagem Tipo 2) e cessação da secreção de insulina (modelagem Tipo 1)^5,6. Experimentalmente, para parar a secreção de insulina, as células β pancreáticas podem ser quimicamente destruídas usando injeções de Estreptozotocina (STZ) ou Alloxan. A STZ tem sido utilizada com sucesso em roedores e zebrafish, resultando em complicações associadas à retinopatia^7,8,9, prejuízos cognitivos¹⁰e regeneração de membros¹¹. No entanto, em zebrafish, β células se regeneram após o tratamento, fazendo com que “injeções de reforço” de STZ sejam necessárias para manter as condições diabéticas¹². Alternativamente, o pâncreas do zebrafish pode ser removido⁶. Estes são procedimentos altamente invasivos, devido às múltiplas injeções, e tempo de recuperação extensiva.

Por outro lado, a hiperglicemia pode ser induzida não invasivamente através da exposição à glicose exógena. Neste protocolo, os peixes ficam submersos em uma solução de glicose altamente concentrada por 24 horas^5,13 ou continuamente durante 2 semanas^14,15,16. A glicose exógena é tomada transdermicamente, por ingestão, e/ou através das brânquias, resultando em níveis elevados de açúcar no sangue. Uma vez que esta técnica não invasiva não manipula diretamente os níveis de insulina, não pode alegar induzir DM tipo 2. No entanto, pode ser usado para examinar complicações induzidas pela hiperglicemia, que é um dos principais sintomas do DM tipo 2.

Recentemente, o mutante de zebrafish pdx1^-/- foi desenvolvido manipulando o gene homeobox 1 pancreático e duodenal, um gene ligado à causa genética do DM tipo 2 em humanos. Usando este mutante, os pesquisadores conseguiram replicar a interrupção do desenvolvimento pancreático, o alto açúcar no sangue e estudar a retinopatia diabética induzida pela hiperglicemia^17,18.

Neste artigo, descrevemos um método de indução de hiperglicemia não invasiva que usa um protocolo de imersão alternada. Este protocolo mantém condições hiperglicêmicas por até 8 semanas com complicações subsequentes observadas. Em suma, os zebrafish adultos são colocados em uma solução de açúcar por 24 horas e, em seguida, uma solução de água por 24 horas. Ao contrário da imersão contínua em soluções externas de glicose, alternar dias entre açúcar e água imita o aumento e a queda do açúcar no sangue no diabetes. Um protocolo de glicose alternado também permite que a hiperglicemia seja induzida por períodos mais longos de tempo, já que os zebrafish não são tão capazes de compensar as altas condições de glicose externa. Como prova de princípio, fornecemos dados mostrando que a hiperglicemia induzida por este protocolo altera a química da retina e a fisiologia.