本文旨在描述一个系统的协议,以获得水平海马脑片在小鼠。这种方法的目的是保持海马纤维通路的完整性,如穿孔路径和青苔纤维道,以评估凹痕陀螺相关的神经过程。
海马是大脑中高度有组织的结构,是边缘系统的一部分,参与记忆的形成和巩固,以及严重脑部疾病的表现,包括阿尔茨海默氏症和癫痫。海马获得高度的内部和相互连接,确保与内部和外部大脑结构的适当沟通。这种连接是通过纤维通路形式的不同信息流实现的。在探索海马的神经生理功能时,大脑切片是一种常用的方法。海马脑片可用于几个不同的应用,包括电生理记录,光显微测量以及一些分子生物学和组织化学技术。因此,大脑切片是评估蛋白质功能、研究神经系统疾病的病理生理过程以及药物发现的理想模型系统。
切片制备有几种不同的方法。脑切片制剂与颤音可以更好地保存组织结构,并保证在切片过程中有足够的氧气供应,这比传统使用组织切片机具有优势。此外,不同的切割平面可用于振动切除脑切片制剂。在这里,提供了一个详细的协议,成功地准备振动切水平海马片小鼠的大脑。与其他切片制剂相比,水平切片允许将海马输入路径(穿孔路径)的纤维保持在切片内完全完好无损的状态,从而有助于研究内皮-海马相互作用。在这里,我们为穆林大脑的解剖、提取和急性水平切片提供了一个彻底的协议,并讨论了这项技术的挑战和潜在缺陷。最后,我们将展示一些例子,用于进一步的应用大脑切片。
对海马的广泛探索开始于斯科维尔和米尔纳报告一个病人(H.M.)在手术切除海马和附近的时间叶结构后无法形成新的,声明性的记忆,作为治疗严重癫痫1。从那一刻起,海马从一般神经元特性和功能到严重的脑部疾病的发展,如癫痫和阿尔茨海默病2,3,4,5,进行了广泛的研究。海马是边缘系统的一部分,由一组参与情感和记忆形成的相关大脑结构组成。由多个纤维通路组成的密集网络实现了海马与内部和外部大脑结构的紧密连接。这些通路包括中线和横向穿孔路径(凹痕陀螺的内皮层,CA3 – CA1 和子)8,青苔纤维路径(凹痕陀螺到 CA3)9和沙弗抵押品/关联通路 (CA3 到 CA1)10 (图 1)。海马是迄今为止探索最广泛的大脑区域之一,因为它的神经元层形成高度保守的层压组织,并有可能获得重要的神经元文化和大脑切片相对容易5。
图1:卡通说明不同的海马区和主要纤维路径。不同的海马区域由实心色线表示:内皮层(EC;黑色)、凹痕陀螺(DG;橙色)、 科努阿莫尼斯 (CA)3(青色)、2(黄色)和1(洋红色)以及亚晶(绿色)。纤维通路以彩色虚线显示:介质(MPP,红色)和横穿孔路径(LPP,蓝色)(从内皮层到凹痕陀螺, CA3、CA1 和亚丘鲁姆)、青苔纤维通路(MF、紫罗兰色)(从凹痕陀螺到 CA3)和沙弗抵押品(SC、棕色)(从 CA3 到 CA1 的紫外线)/关联通路(AC,浅绿色)(从 CA3 到 CA1 的相对)。 请点击这里查看此数字的较大版本。
大脑切片协议经常导致从更遥远的大脑区域到感兴趣的区域5失去连接。此外,毛细血管不再功能5和血液循环被剥夺11。尽管有这些限制,大脑切片仍然主要用于研究海马的神经生理功能,由于一些优点。首先,海马的提取速度很快,不需要很多材料。唯一的基本仪器包括解剖包,实验室水浴,获得碳水化合物和振动微切除术(颤音)13。大脑切片技术的其他资产是绕过血脑屏障(BBB)和在实验5开始前洗掉内源释放的分子,这使得研究药物的效果具有相对精确的剂量控制14。此外,大脑切片保留了海马15、16号内部的细胞结构和突触回路,其中神经解剖学和具有神经元连接和复杂神经元-胶质相互作用的局部环境保存了4、11、17。此外,海马纤维连接主要是单向的,海马神经元具有很高的突触可塑性,这极大地简化了高质量电生理记录的收集和解释,以便了解神经过程18,19。重要的是,大脑切片是适用于各种不同科学技术的宝贵资产,从分子生物技术到成像记录,一直到电生理测量12、20、21、22、23、24、25、26。
如上所述,海马脑切片是研究突触连接结构和功能特征的有力实验工具。这提供了评估化学物质或突变对神经元兴奋性和可塑性的影响的机会。
急性脑切片制剂呈现一种相对敏感的技术,最佳切片质量高度取决于理想的实验条件,包括动物的年龄、安乐死的方法、解剖和切片的速度、切片溶液和参数(如切片速度)以及切片恢复的条件4。因此,设计精良的协议是最重要的,并确保在不同的研究单位13的可重复性。
在这里,我们提供了急性水平海马切片制剂的详细协议,旨在保持海马横穿路和中穿孔路径和青苔纤维通路的完整性,允许研究凹痕陀螺相关过程9。我们将详细描述解剖、提取和水平切片 Murine 大脑的关键步骤,然后是钙微氟化记录和在基线条件下和在野生类型 C57BL/6J 小鼠大脑切片中的 LTP 诱导协议期间的现场兴奋性后潜在记录 (fEPSP) 的代表性结果。
虽然在神经科学界很普遍,但大脑切片制剂也面临着几个缺点。例如,与大脑感兴趣区域的输入和输出连接不再连接在大脑切片中。此外,一旦分离,组织开始逐渐退化,这个过程可能会改变大脑切片的生理条件。这个主题尤其令人关注,因为大多数脑切片记录需要几分钟到几个小时,这导致长时间的实验日,在实验开始前被分离到6-8小时的组织上进行录音。此外,脑脊液和血液循环在切片准备过程中中断,这可能导致大脑切片内缺乏重要的内源性化合物。最明显的是,切片过程本身可能会导致机械组织损伤,从而损害获得的结果。然而,大脑切片制剂的实际益处仍然大于其缺点,这就是为什么他们在神经科学研究中提出了一种备受重视和采用的技术。
急性海马脑切片是一种强大的,因此广泛使用的技术,以研究神经元过程从分子水平到复杂的脑回路研究。这是基于海马的理想神经解剖,可以很容易地保存在切片准备18。因此,海马脑片用于各种科学研究项目,包括药物筛选17,神经元和突触特性研究涉及认知功能40,41,和病理大脑状况研究14,42,43。但是,广泛的不同应用还会导致各种可用的切片制备方案,这些协议在各种参数(如解剖条件和切割平面方向等)上可能有所不同。因此,必须确定科学项目的确切研究问题,以便选择适当的切片制备方案。
组织直升机提出了最古老的使用技术之一,以准备海马脑切片44,45。这种制备方法的主要优点包括直升机成本低,使用方便快捷。然而,组织斩波器引起机械应力,导致形态改变和细胞死亡47。相比之下,振动切除术是一台相当昂贵的机器,切片制备的时间显著增加,这可能会对切片的质量产生影响。然而,振动切除术通常提供一种更温和的方式从组织中分离切片,并允许保持大脑很好地冷却和氧气在整个隔离过程,从而改善切片属性46。因此,几个小组正在标准地采用这项技术,并提出了使用颤音16,30,48制备急性海马脑切片的协议。虽然有些协议只提供了切片本身的一些细节,而是侧重于这种切片准备48的具体应用,其他协议提供了详细的切片协议,不同的切割平面或其他协议细节(如,agarose嵌入或切片/恢复解决方案)在本条27,30。
这里描述的协议提出了一个简单的方法,以准备高质量的急性水平海马鼠脑切片从年轻的动物。该协议是特别有用的,以保持穿孔路径(中等和横向),呈现海马输入路径,其中项目从内皮层到海马8,49,50。射手座,冠状体,以及孤立的海马横向切片制剂不能适当保存穿孔路径,这主要源于内皮层的第二层和V层和项目到海马体18内的几个区域。由于内皮层相对于海马体的解剖定位,水平脑切片是必要的,以保持切片准备31内完全完整的穿孔路径纤维。此外,水平切片理想地保留了从凹痕陀螺投射到海马9,30,50内的CA3神经元的青苔纤维。因此,这种制备方法对于研究海马输入途径和DG相关过程的研究具有很高的价值。此外,该协议允许调查沙弗抵押途径50。然而,在研究CA3到CA1纤维投影时,下垂和日冕脑切片制剂更常用,大概是因为它们的制备时间稍快,可以增加获得高质量切片的机会。然而,水平海马切片制剂是一个强大的研究工具,因为它允许保存和研究一个切片半球内的所有海马纤维通路。例如,在多极测定录音中,当电路响应被研究时,这尤其有用。
准备脑切片时,一个主要问题是适当保存脑组织。这是通过我们的协议中的几个关键步骤来实现的,包括快速解剖,连续和足够的氧气和冷却的组织,并通过使用低钠,高糖切片溶液39,51的保护性切割方法保护脑组织。尽管此处描述的协议成功率约为 90%,但与来自较老或遗传多样性动物的组织合作或试图保护特定细胞群时,可能需要可能需要额外的保护步骤。据报道,已经有几种方法可以保护敏感的脑组织制剂。这些方法包括使用基于NMDG的切片溶液来减少钠渗透52,在切片溶液中使用高镁水平来阻止NMDA受体活性53,以及在恢复期23期间长期使用保护性溶液。所有这些措施都将导致兴奋中毒程度的降低。此外,在与年龄较大的动物27工作时,经常使用带有冰冷保护ACSF溶液的转心输液。”
急性海马脑片非常适合和广泛用于电生理学研究的原因,如高振幅信号,可以从相对厚(300-500 μm)急性脑切片获得,这保证了高信号与噪声比11。标准使用的电生理应用包括细胞外场记录和电压或电流夹模式下的细胞内全细胞录音。为了获得高质量的电生理数据,切片健康是首要问题,可以通过严格遵循所提交的协议来保证。但是,由于切片制剂是一种高度敏感的技术,因此应在每个实验开始前定期进行质量检查。几个参数可以用作切片的质量检查,并通过输入输出曲线和基线 fEPSP 或 EPSC 记录19进行标准评估。然而,应当指出,次优电生理特性可能产生于实验错误,如电极定位、方向甚至损坏,并不仅仅代表制备切片的健康。因此,建议执行额外的质量控制,例如在 40 倍目标下对细胞进行简单的可视化和评估,或 DAPI 细胞核染色。这种质量检查可用于在几次切片准备会话中确认不断的切片健康。
钙微氟学是研究海马脑切片的一种不太常用的技术。然而,这项技术对标准的细胞外和细胞内电极记录具有附加价值,因为它允许可视化和量化细胞内钙通量,这在神经元和突触信号中非常重要。细胞内钙浓度的变化涉及神经递质囊泡释放,先知后潜在生成,突触可塑性和轴神经传导的调节54,55,56。作为这项技术的例证(图4),我们使用了一种市售的钙染料。无可辩辩地,用钙染料治疗组织切片会产生困难,例如增加实验时间框架以及低位神经元细胞的低效负荷。然而,这种技术的变化可以用来规避这些技术挑战。例如,可以将钙测量和海马片中的贴片夹录音相结合。通过这种方式,钙荧光染料可以通过贴片移液器加载到特定的细胞中,从而可以在一个感兴趣的特定细胞中测量钙动力学。或者,基因工程动物表达钙指标,GCaMP58,无论是在整个大脑,或由细胞特异性促进运动驱动,可以使用。有趣的是,GCaMP动物的脑组织与感兴趣的蛋白质有直接联系,可以提供机会来确定神经元表达模式或研究钙火花和波的参与。
总之,我们为成功从小鼠身上制备健康可行的水平海马脑片提供指南,用于电生理和成像记录。这种方法对于获取在凹痕陀螺中描述的大脑病理学中发生的神经变化是非常有用的。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢VIB-KU鲁汶脑病研究中心电生理学部门在肯佩·维尔达博士和乔里斯·德维特教授的监督下使用他们的研究设施。此外,我们感谢在KU鲁汶的离子通道研究实验室和子宫内膜、子宫内膜异位症和生殖医学实验室的所有成员,感谢他们有益的讨论和意见。
该项目已获得研究基金会-佛兰德斯(G.084515N和G.0B1819N至J.V.)和KU Leuven研究理事会(C1资助C14/18/106至J.V.)的资金。K.P. 是 FWO [PEGASUS]2 玛丽·斯克索多夫斯卡-居里研究员,根据与研究基金会佛兰德斯 (FWO) (12T0317N) 签订的玛丽·斯考多夫斯卡-居里赠款协议 (665501) 获得了欧盟”地平线 2020″研究与创新计划的资金。K.H.是比利时佛兰德斯研究基金会博士后研究员(12U7918N)。
Anesthesia chamber | home made – Generic | N/A | plexiglas |
Anesthesia vaporizer | Dräger & MSS International Ltd | Isoflurane Vapor 19.3 & MSS Isoflurane | to vaporize isoflurane for rodent anesthetization |
Barrels for the perfusion system | TERUMO | Hypodermic syringes without needle | https://www.terumotmp.com/products/hypodermics/terumo-hypodermic-syringes-without-needle.html |
Bicuculline methiodide | hellobio | HB0893 | https://www.hellobio.com/bicuculline-methiodide.html |
Borosilcate glass capillaries | Science Products | GB150F-8P | https://science-products.com/en/shop/micropipette-fabrication-1/capillary-glass-for-micropipette-pullers/borosilicate-glass-capillaries/borosilicate-filament-polished |
Calcium chlorid dihydrate | Merck | 102382 | https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Calcium-chloride-dihydrate,MDA_CHEM-102382?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F |
Calcium Imaging software | Till Photonics | LiveAcquisition v2.3.0.18 | |
Carbogen tank | Air Liquide | Alphagaz mix B50 | Gasmixture CO2/O2: 5/95, purity 5 |
Cluster microelectrode | FHC | CE2C55 | https://www.fh-co.com/product/cluster-microelectrodes/ |
Culture dish (35 mm) | Corning Life Sciences | 353001 | https://ecatalog.corning.com/life-sciences/b2c/US/en/Cell-Culture/Cell-Culture-Vessels/Dishes%2C-Culture/Falcon®-Cell-Culture-Dishes/p/353001 |
Culture dish (90 mm) | Thermo Fisher Scientific | 101VR20 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/101R20#/101R20 |
Curved forceps | Fine Science tools | 11270-20 | https://www.finescience.de/de-DE/Products/Forceps-Hemostats/Dumont-Forceps/Dumont-7b-Forceps/11270-20 |
D-AP5 | hellobio | HB0225 | https://www.hellobio.com/dap5.html |
D-(+)-Glucose monohydrate | Sigma Aldrich | 16301 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/16301?lang=en®ion=BE |
Digital CMOS camera | HAMAMATSU | ORCA-spark C11440-36U | https://www.hamamatsu.com/eu/en/product/type/C11440-36U/index.html |
Dissection scissors | Fine Science tools | 14058-09 | https://www.finescience.de/de-DE/Products/Scissors/Standard-Scissors/Fine-Scissors-ToughCut®/14058-09 |
DNQX | hellobio | HB0262 | https://www.hellobio.com/dnqx-disodium-salt.html |
EMCCD camera | Andor | iXon TM + DU-897E-CSO-#BV | https://andor.oxinst.com/products/ixon-emccd-cameras?gclid=CjwKCAjw97P5BRBQEiwAGflV6ULsKjXfhN2YZxtvsWAmF4QghyXZKuqYHVMa6KU9JyS80ATQkSKeBBoCIM0QAvD_BwE |
EPC10 USB Double Patch Clamp Amplifier | HEKA Elektronik | 895278 | https://www.heka.com/sales/brochures_down/bro_epc10usb.pdf |
Filter paper | VWR | 516-0818 | grade 413 |
Fine brush | Raphael Kaerell | 8204 | Size #1 |
18G needle | Henke Sass Wolf Fine-Ject | 18G X 1 1/2" 4710012040 | https://www.henkesasswolf.de/cms/de/veterinaer_produkte/produkte_vet/einmalkanuelen/hsw_henke_ject_einmalkanuelen/ |
Isoflurane | Dechra Veterinary Products | Iso-Vet 1000mg/g | 250 ml bottle |
Loctite 406 | Henkel Adhesive technologies | Loctite 406 | Super glue |
Magnesium sulfate heptahydrate | Merck | 105886 | https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Magnesium-sulfate-heptahydrate,MDA_CHEM-105886?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F |
Micromanipulator | Luigs & Neumann | SM-10 with SM-7 remote control system | https://www.luigs-neumann.org |
Microscope (for calcium imaging) | Olympus | BX51WI | https://www.olympus-lifescience.com/de/microscopes/upright/bx61wi/ |
Microscope (for ephys recordings) | Zeiss | Axio Examiner.A1 | https://www.micro-shop.zeiss.com/de/de/system/axio+examiner-axio+examiner.a1-aufrechte+mikroskope/10185/ |
Microscope light source | CAIRN Research | dual OptoLed power supply | https://www.cairn-research.co.uk/product/optoled/ |
Monochromator | Till Photonics | Polychrome V | |
N-Methyl-D-aspartic acid (NMDA) | Sigma Aldrich | M3262 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m3262?lang=en®ion=BE |
Oregon Green® 488 BAPTA-1 | Invitrogen Molecular Probes | #06807 | 10x50ug |
Osmometer | Wescor | 5500 vapor pressure osmometer | to verify osmolarity of salt solutions |
Peristaltic pump | Thermo Fisher Scientific | Masterflex C/L 77120-62 | https://www.fishersci.be/shop/products/masterflex-peristaltic-c-l-dual-channel-pump-2/p-8004229 |
pH meter | WTW | inoLab series pH 720 | https://www.geminibv.nl/wp-content/uploads/manuals/wtw-720-ph-meter/wtw-inolab-ph-720-manual-eng.pdf |
Pipette puller | Sutter Instrument | P-1000 | https://www.sutter.com/MICROPIPETTE/p-1000.html |
Potassium chlorid | Chem-lab | CL00.1133 | https://www.chem-lab.be/#/en-gb/prod/1393528 |
Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 104873 | https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Potassium-dihydrogen-phosphate,MDA_CHEM-104873?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F |
Razor blade to prepare hemispheres | SPI supplies | Safety Cartridge Dispenser – Pkg/10 | GEM Scientific Single Edge Razor Blades |
Razor blade for vibratome | Ted Pella Inc | 121-6 | double edge breakable style razor blades (PTFE-coated stainless steel) |
Recovery chamber | home made – Generic | N/A | to collect and store brain slices in (see details in manuscript) |
Scissors | Any company | N/A | Blade should be well sharpened and at least 15 cm long for easy decapitation |
Silver electrode wire | Any company | for recording and reference electrodes | |
Sodium dihydrogen phosphate dihydrate | Merck | 106342 | https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Sodium-dihydrogen-phosphate-dihydrate,MDA_CHEM-106342?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F |
Sodium hydrogen carbonate | Alfa Aesar | 14707 | https://www.alfa.com/en/catalog/014707/ |
Sodium chlorid | Fisher Scientific | S/3160/60 | https://www.fishersci.co.uk/shop/products/sodium-chloride-certified-ar-analysis-meets-analytical-specification-ph-eur/10428420 |
Software for field recordings | HEKA Elektronik | PatchMaster | https://www.heka.com/downloads/software/manual/m_patchmaster.pdf |
Spatula | Sigma Aldrich | S9147-12EA | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s9147?lang=en®ion=BE |
Stimulator | A.M.P.I | ISO-FLEX | http://www.ampi.co.il/isoflex.html |
Sucrose | VWR International Ltd. | 102745C | https://es.vwr-cmd.com/ex/downloads/magazine/lupc_userguide_uk.pdf |
Tubing for carbogen, perfusion and suction lines 1 | Warner Instruments | 64-0167 | Tygon tubing (TY-50) for standard valve systems |
Tubing for carbogen, perfusion and suction lines 2 | Fisher Scientific | 800/100/200 & 800/100/280 | Smiths Medical Portex Fine Bore LDPE Tubing |
Vacuum pump | home made – Generic | N/A | |
8 valve multi-barrel perfusion system | home made | N/A | consists of barrels, tubing and a self-made automated valve control (specifications of all purchased parts can be found in this Table) |
Magnetic valves (to control the perfusion lines) | NResearch Inc. | p/n 161P011 | https://nresearch.com/ |
Vibratome | Leica | 14912000001 | Semi-automatic vibrating blade microomei VT1200 |
Water bath | Memmert | WNB 7 | https://www.memmert.be/wp-content/uploads/2019/09/Memmert-Waterbath-WNB-7.en_.pdf |
Water purification system | Merck | Synergy millipore | to obtain highly purified water |
12-well plates | Greiner Bio-One | CELLSTAR, 665180 | http://www.greinerbioone.com/UserFiles/File/Catalogue%202010_11/UK/3680_005-Kapitel1_UK.pdf |