أكسدة سريعة للبروتينات الضوئية هي تقنية ناشئة للتوصيف الهيكلي للبروتينات. مختلف المذيبات المضافة و ligands تختلف خصائص الهيدروكسيل الراديكالية الكسح. لمقارنة بنية البروتين في ظروف مختلفة، مطلوب التعويض في الوقت الحقيقي من الجذور الهيدروكسيل ولدت في رد الفعل لتطبيع ظروف رد الفعل.
التأكسد الكيميائي الضوئي السريع للبروتينات (FPOP) هو تقنية بيولوجيا هيكلية تعتمد على القياس الطيفي الكتلي الذي يسبر مساحة السطح التي يمكن الوصول إليها من البروتينات. تعتمد هذه التقنية على رد فعل سلاسل جانبية من الأحماض الأمينية مع الجذور الهيدروكسيلية تنتشر بحرية في الحل. FPOP يولد هذه الجذور في الموقع عن طريق التحليل الضوئي بالليزر من بيروكسيد الهيدروجين، وخلق انفجار من الجذور الهيدروكسيل التي تستنفد على ترتيب ميكروثانية. عندما تتفاعل هذه الجذور الهيدروكسيل مع سلسلة جانبية من الأحماض الأمينية التي يمكن الوصول إليها من المذيبات ، فإن منتجات التفاعل تظهر تحولًا جماعيًا يمكن قياسه وتحديده كمًا بواسطة قياس الطيف الكتلي. وبما أن معدل رد فعل الأحماض الأمينية يعتمد جزئياً على متوسط سطح المذيبات التي يمكن الوصول إليها من تلك الأحماض الأمينية، فإن التغيرات المقاسة في كمية أكسدة منطقة معينة من البروتين يمكن أن ترتبط بشكل مباشر بالتغيرات في إمكانية الوصول إلى المذيبات في تلك المنطقة بين التشكلات المختلفة (على سبيل المثال، اللتيند المقيد مقابل الليغاند الحر، والمونمر مقابل التجميع، إلخ.) وقد طبقت FPOP في عدد من المشاكل في علم الأحياء، بما في ذلك التفاعلات البروتين البروتين، والتغيرات البروتين التشكلية، والبروتين liga.1. كما أن التركيز المتاح من الجذور الهيدروكسيل يختلف استناداً إلى العديد من الظروف التجريبية في تجربة FPOP، من المهم رصد الجرعة الجذرية الفعالة التي يتعرض لها تحليل البروتين. ويتحقق هذا الرصد بكفاءة من خلال دمج مقياس الجرعات مضمنة لقياس إشارة من تفاعل FPOP، مع فلونس الليزر تعديلها في الوقت الحقيقي لتحقيق المبلغ المطلوب من الأكسدة. مع هذا التعويض، يمكن تحديد التغيرات في تضاريس البروتين التي تعكس التغيرات التكونية، والأسطح ملزمة ليغاند، و/ أو التفاعل البروتين البروتيني واجهات التفاعل في عينات غير متجانسة باستخدام كميات عينة منخفضة نسبيا.
الأكسدة الكيميائية الضوئية السريعة للبروتينات (FPOP) هي تقنية ناشئة لتحديد التغيرات الطوبوغرافية البروتينية عن طريق تعديل فائق السرعة في منطقة السطح المكشوفة للمذيبات من البروتينات متبوعاً بالكشف عن البروتينات LC-MS1. FPOP يولد تركيز عال من الجذور الهيدروكسيل في الموقع بواسطة الليزر الأشعة فوق البنفسجية فلاش ضوء بيروكسيد الهيدروجين. هذه الجذور الهيدروكسيل هي رد الفعل جدا وقصيرة الأجل، تستهلك على مقياس زمني تقريبا ميكرو ثانية في ظل ظروف FPOP2. هذه الجذور الهيدروكسيل تنتشر من خلال المياه وأكسدة مختلف المكونات العضوية في حل بمعدلات حركية تتراوح عموما من سريع (~6 6 M-1 S-1)لنشر التي تسيطر عليها3. عندما الهيدروكسيل الراديكالية لقاءات سطح البروتين، فإن الراديكالية تتأكسد سلاسل جانبية الأحماض الأمينية على سطح البروتين، مما أدى إلى تحول كتلة من أن الأحماض الأمينية (الأكثر شيوعاً الجمع الصافي لذرة أكسجين واحدة)4. يعتمد معدل تفاعل الأكسدة في أي حمض أميني على عاملين: التفاعل المتأصل في تلك الأحماض الأمينية (التي تعتمد على السلسلة الجانبية والسياق التسلسلي)4،5 وإمكانية الوصول إلى تلك السلسلة الجانبية إلى جذر الهيدروكسيل الناشر ، الذي يرتبط ارتباطًا وثيقًا بمتوسط مساحة السطح التي يمكن الوصول إليها من المذيبات6،7. وقد لوحظ كل من الأحماض الأمينية القياسية باستثناء الجليسين كما وصفت هذه الجذور الهيدروكسيل عالية التفاعل في التجارب FPOP, وإن كان في غلة مختلفة على نطاق واسع; في الممارسة العملية، Ser، Thr، Asn، وعلاء ونادرا ما ينظر إليها على أنها المؤكدة في معظم العينات إلا تحت جرعات متطرفة عالية والتي حددتها دقيق وحساسة ETD التجزئةالمستهدفة 8،9. بعد الأكسدة، يتم إخماد العينات لإزالة بيروكسيد الهيدروجين والمواد تأكسدية ثانوية (أكسيد فائق، أكسجين مفرد، هيدروبيروكسيد البيبتيديل، الخ.) ثم يتم هضم العينات المطفأة بشكل بروتيوليالي لتوليد خليط من الببتيدات المؤكدة ، حيث يتم تجميد المعلومات الهيكلية كـ “لقطة” كيميائية في أنماط منتجات الأكسدة من مختلف الببتيدات(الشكل 1). يستخدم الكروماتوغرافيا السائلة مقرونة إلى القياس الطيفي الشامل (LC-MS) لقياس كمية أكسدة الأحماض الأمينية في الببتيد البروتيني معين استناداً إلى الكثافة النسبية للإصدارات المؤسدة وغير المؤكد من ذلك الببتيد. بمقارنة هذه البصمة التأسدية من نفس البروتين التي تم الحصول عليها في ظل ظروف مختلفة من التشكل (على سبيل المثال، ملزمة بالليغان مقابل ليجوند خالية)، يمكن أن ترتبط الاختلافات في كمية أكسدة منطقة معينة من البروتين بشكل مباشر مع الاختلافات في مساحة السطح التي يمكن الوصول إليها من قبل المذيبات في تلك المنطقة6،7. القدرة على توفير معلومات الطبوغرافية البروتين يجعل FPOP تكنولوجيا جذابة لتحديد هيكل أعلى من أجل البروتينات، بما في ذلك في اكتشاف البروتين العلاجي والتنمية10،11.
الشكل 1: نظرة عامة على FPOP. يتم تعديل سطح البروتين بشكل مُساهم بواسطة الجذور الهيدروكسيلية شديدة التفاعل. سوف تتفاعل الجذور الهيدروكسيل مع سلاسل جانبية من الأحماض الأمينية من البروتين بمعدل يتأثر بقوة بإمكانية الوصول إلى المذيبات في السلسلة الجانبية. التغيرات الطبوغرافية (على سبيل المثال، بسبب ربط ليغاند كما هو مبين أعلاه) سوف تحمي الأحماض الأمينية في منطقة التفاعل من التفاعل مع الجذور الهيدروكسيل، مما يؤدي إلى انخفاض في كثافة الببتيد المعدلة في إشارة LC-MS. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
مكونات مختلفة موجودة في حل FPOP (على سبيل المثال، اليغاندات، واسحات، والمخازن) لها نشاط الكسح مختلفة نحو الجذور الهيدروكسيل ولدت على التحليل الضوئي ليزر من بيروكسيد الهيدروجين3. وبالمثل، قد يغير تغير صغير في تركيز البيروكسيد، والفلونة بالليزر، وتكوين المخزن المؤقت الجرعة الجذرية الفعالة، مما يجعل استنساخ بيانات FPOP يشكل تحديا عبر العينات وبين مختبرات مختلفة. ولذلك، فمن المهم أن تكون قادرة على مقارنة جرعة الهيدروكسيل الراديكالية المتاحة للرد مع البروتين في كل عينة باستخدام واحدة من عدة الجرعات الهيدروكسيل الجذر المتاحة12،13،14،15،16. تعمل مقاييس الهيدروكسيل الراديكالية من خلال التنافس مع التحليل (ومع جميع الزبالين في الحل) لتجمع الجذور الهيدروكسيلية؛ يتم قياس الجرعة الفعالة من الجذور الهيدروكسيل عن طريق قياس كمية أكسدة الدوسيمتر. لاحظ أن “الجرعة الجذرية الهيدروكسيل الفعالة” هي وظيفة من كل من التركيز الأولي للهيدروكسيل الراديكالية المتولدة ونصف العمر من الراديكالية. هذه المعلمتين تعتمد جزئيا على بعضها البعض، مما يجعل النمذجة الحركية النظرية معقدة إلى حد ما (الشكل 2). يمكن أن يكون اثنين من العينات مختلفة بعنف جذرية الأولية نصف حياة مع الحفاظ على نفس الجرعة الراديكالية الفعالة عن طريق تغيير التركيز الأولي من الهيدروكسيل الراديكالية التي شكلت; أنها لا تزال تولد آثار أقدام متطابقة17. Adenine13 و Tris12 هي مريحة hydroxyl الجذر دوسيمترات لأن مستوى الأكسدة الخاصة بهم يمكن قياسها عن طريق مطياف الأشعة فوق البنفسجية في الوقت الحقيقي، مما يسمح للباحثين لتحديد بسرعة عندما يكون هناك مشكلة مع جرعة جذرية الهيدروكسيل فعالة واستكشاف مشكلتهم. لحل هذه المشكلة، من المهم وجود مقياس الجرعات المضمن الموجود في نظام التدفق مباشرة بعد موقع التشعيع الذي يمكنه مراقبة الإشارة من تغيرات امتصاص الأدينين في الوقت الفعلي. وهذا يساعد في تنفيذ التجارب FPOP في المخازن المؤقتة أو أي سذر الأخرى مع مستويات مختلفة على نطاق واسع من الهيدروكسيل قدرة الكسحالجذرية 17. ويمكن تنفيذ هذا التعويض الجرعة الجذرية في الوقت الحقيقي, تسفر عن نتائج لا يمكن تحديدها إحصائيا لنفس المطابقة عن طريق تعديل الجرعة الراديكالية الفعالة.
في هذا البروتوكول، لدينا إجراءات مفصلة لتنفيذ تجربة FPOP نموذجية مع تعويض الجرعة الراديكالية باستخدام أدينين كمقياس الجرعات الراديكالية البصرية الداخلية. هذه الطريقة تسمح للمحققين بمقارنة آثار الأقدام عبر ظروف FPOP التي لديها قدرة الكسح المختلفة من خلال أداء التعويض في الوقت الحقيقي.
الشكل 2: محاكاة حركية للتعويض القائم على قياس الجرعات. 1 mM أدينين دوسيميت يتم قياس الاستجابة في 5 μM lysozyme التحليل مع تركيز جذري هيدروكسيل 1 mM الأولي (▪أو تي1/2=53 ن س), وتعيين كاستجابة مقياس الجرعات المستهدفة (أسود). عند إضافة 1 mM من الهستيدين الكاسح الزبال، استجابة مقياس الجرعات (الأزرق) يقلل جنبا إلى جنب مع كمية أكسدة البروتين بطريقة متناسبة (السماوي). وينخفض أيضا نصف عمر جذر الهيدروكسيل (▪OH t1/2=39 ns). عندما يتم زيادة كمية من هيدروكسل جذري ولدت لإعطاء عائد مكافئ من الجرعات المؤسدة في العينة مع 1 mm الهستيدين الكاسح كما يتحقق مع 1 mM هيدروكسل الراديكالية في غياب زبال (الأحمر)، وكمية أكسدة البروتين التي تحدث على نحو مماثل يصبح متطابقة (أرجواني)، في حين أن نصف العمر الراديكالي الهيدروكسيل يقلل أكثر من ذلك (▪OH ر1/2=29 ن). تم تكييفها بإذن من Sharp J.S.، Am Pharmaceut Rev 22، 50-55، 2019. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
تقنيات التحاليل الطيفية القائمة على الكتلة، بما في ذلك تبادل الهيدروجين الديوتيريوم، الربط الكيميائي، وضع العلامات التكافؤة، وقياس الطيف الكتلي للرذاذ الأصلي وحركة الأيونات قد تزايد بسرعة في شعبيتها بسبب مرونتها وحساسيتها وقدرتها على التعامل مع الخلائط المعقدة. FPOP تفتخر العديد من الم?…
The authors have nothing to disclose.
نحن نعترف بتمويل البحوث من المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة منحة R43GM125420-010 لدعم التنمية التجارية لجهاز FPOP على مقاعد البدلاء وR01GM127267 لتطوير توحيد ومقاييس بروتوكولات لFPOP عالية الطاقة.
Adenine | Acros Organics | 147440250 | Soluble in water upto 3.5 mM |
Aperture | Edmund Optics | 39-905 | 1000 μm Aperture Diameter, Gold-Plated Copper Aperture |
Aperture holder | Edmund Optics | 53-287 | 25.8mm Outer Diameter, Precision Pinhole Mount |
Catalse | Sigma Aldrich | C-40 | Catalase from bovine liver, lyophilized powder, ≥10,000 units/mg protein |
COMPex Pro laser | Coherent | 1113836 | COMPexPRO 102, F-Vversion, KrF laser, No XeCl |
Dithiotheitol (DTT) | Promega | V3151 | DTT, Molecular Grade (DL-Dithiothreitol) |
Fraction collector | GenNext Technologies, Inc. | N/A | Automated fraction collector |
Fused silica capillay | Molex | 1068150023 | Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 100 µm, Outer Diameter 375 µm, TSP100375 |
Glutamine | Acros Organics | 119951000 | L(+)-Glutamine, 99% |
Holder for lens | Edmund Optics | 03-668 | 53 mm Outer Diameter, Three-Screw Adjustable Ring Mount |
Hydrogen peroxide | Fisher Scientific | H325-100 | Hydrogen Peroxide, 30% (Certified ACS), Fisher Chemical |
LC-MS/MS system | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBCX | Dionex Ultimate 3000 coupled to Orbitap Fusion Tribrid mass spectrometer |
Mas spec grade Acetonitrile | Fisher Scientific | A955-1 | Acetonitrile, Optima LC/MS Grade, Fisher Chemical |
Mass spec grade formic acid | Fisher Scientific | A117-50 | Formic Acid, 99.0+%, Optima™ LC/MS Grade, Fisher Chemical |
Mass spec grade water | Fisher Scientific | W6-4 | Water, Optima LC/MS Grade, Fisher Chemical |
MES buffer | Sigma Aldrich | M0164 | MES hemisodium salt |
Methionine amide | Bachem | 4000594.0005 | H-met-NH2.HCl |
Micro V clamp | Thor Labs | VK250 | Micro V-clamp with stainless steel blades |
Motorized stage | Edmund Optics | 68-638 | 50mm Travel Motorized Stage System with Manual Control |
Nano C18 colum | Thermo Scientific | 164534 | Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Columns |
Optical bench | Edmund Optics | 56-935 | 18" x 18" breadboard |
Pioneer FPOP Module System | GenNext Technologies, Inc. | N/A | Inline FPOP Radical Dosimetry System |
Post holder | Edmund Optics | 58-979 | 3" Length, ¼-20 Thread, Post Holder |
Sodium phosphate dibasic | Fisher Scientific | BP331-500 | Sodium Phosphate Dibasic Heptahydrate (Colorless-to-White Crystals), Fisher BioReagents |
Sodium phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP330-500 | Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate (Colorless-to-white Crystals), Fisher BioReagents |
Syringe | Hamilton | 81065 | 100 µL, Model 1710 RN SYR, Small Removable NDL, 22s ga, 2 in, point style 3 |
Syringe pump | KD Scientific | 788101 | Legato 101 syringe pump |
Trap C18 column | Thermo Scientific | 160454 | Thermo Scientific Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Columns |
Tris | Sigma Aldrich | 252859 | Tris(hydroxymethyl)aminomethane |
Trypsin | Promega | V5111 | Sequencing Grade Modified Trypsin |
UV plano convex lens | Edmund Optics | 84-285 | 30 mm Dia. x 120 mm FL Uncoated, UV Plano-Convex Lens |