La oxidación fotoquímica rápida de proteínas es una técnica emergente para la caracterización estructural de proteínas. Diferentes aditivos solventes y ligandos tienen variadas propiedades de barrido hidroxilo radical. Para comparar la estructura proteica en diferentes condiciones, se requiere una compensación en tiempo real de los radicales hidroxilo generados en la reacción para normalizar las condiciones de reacción.
La oxidación fotoquímica rápida de proteínas (FPOP) es una técnica de biología estructural basada en espectrometría de masas que sondea la superficie accesible al solvente de las proteínas. Esta técnica se basa en la reacción de las cadenas laterales de aminoácidos con radicales hidroxilo que se difunden libremente en solución. FPOP genera estos radicales in situ por fotólisis láser de peróxido de hidrógeno, creando una ráfaga de radicales hidroxilo que se agota en el orden de un microsegundo. Cuando estos radicales hidroxilo reaccionan con una cadena lateral de aminoácidos accesibles al disolvente, los productos de reacción presentan un cambio de masa que se puede medir y cuantificar mediante espectrometría de masas. Dado que la tasa de reacción de un aminoácido depende en parte de la superficie accesible del disolvente promedio de ese aminoácido, los cambios medidos en la cantidad de oxidación de una región determinada de una proteína pueden correlacionarse directamente con los cambios en la accesibilidad del disolvente de esa región entre diferentes conformaciones (por ejemplo, ligando-unido versus ligando-libre, monómero vs. agregado, etc.) FPOP se ha aplicado en una serie de problemas en la biología, incluyendo interacciones proteína-proteína, cambios en la conformación de proteínas, y unión proteína-ligand. Dado que la concentración disponible de radicales hidroxilo varía en función de muchas condiciones experimentales en el experimento FPOP, es importante controlar la dosis radical efectiva a la que está expuesto el analito proteico. Este monitoreo se logra eficientemente mediante la incorporación de un dosímetro en línea para medir la señal de la reacción FPOP, con fluencia láser ajustada en tiempo real para lograr la cantidad deseada de oxidación. Con esta compensación, los cambios en la topografía proteica que reflejan cambios en la conformación, superficies de unión de ligandos y/o interfaces de interacción proteína-proteína se pueden determinar en muestras heterogéneas utilizando cantidades de muestra relativamente bajas.
La oxidación fotoquímica rápida de proteínas (FPOP) es una técnica emergente para la determinación de cambios topográficos proteicos mediante la modificación covalente ultrarrápida de la superficie expuesta al disolvente de proteínas seguida de la detección por LC-MS1. FPOP genera una alta concentración de radicales hidroxilo in situ por fotolisis flash láser UV de peróxido de hidrógeno. Estos radicales hidroxilo son muy reactivos y de corta duración, consumidos en aproximadamente una escala de tiempo de microsegundos bajo condiciones FPOP2. Estos radicales hidroxilo se difunden a través del agua y oxidan varios componentes6 orgánicos en solución a tasas cinéticas que generalmente van desde rápido (10 M-1 s-1) a3controlado por difusión. Cuando el radical hidroxilo se encuentra con una superficie de proteína, el radical oxidará las cadenas laterales de aminoácidos en la superficie de la proteína, lo que resulta en un cambio de masa de ese aminoácido (más comúnmente la adición neta de un átomo de oxígeno)4. La velocidad de la reacción de oxidación en cualquier aminoácido depende de dos factores: la reactividad inherente de ese aminoácido (que depende de la cadena lateral y del contexto de secuencia)4,5 y la accesibilidad de esa cadena lateral al radical hidroxilo difusor, que se correlaciona estrechamente con la superficie accesible del disolvente medio6,7. Todos los aminoácidos estándar excepto la glicina se han observado como etiquetado por estos radicales hidroxilo altamente reactivos en experimentos FPOP, aunque con rendimientos muy diferentes; en la práctica, Ser, Thr, Asn y Ala rara vez se consideran oxidados en la mayoría de las muestras, excepto bajo dosis de radicales altos e identificados por la cuidadosa y sensible fragmentación específica de ETD8,,9. Después de la oxidación, las muestras se apagan para eliminar el peróxido de hidrógeno y los oxidantes secundarios (superóxido, oxígeno singlete, hidroperóxidos de peptidil, etc.) Las muestras insaciadas se digieren proteolíticamente para generar mezclas de péptidos oxidados, donde la información estructural se congela como una “instantánea” química en los patrones de los productos de oxidación de los diversos péptidos (Figura 1). La cromatografía líquida acoplada a la espectrometría de masas (LC-MS) se utiliza para medir la cantidad de oxidación de aminoácidos en un péptido proteolítico determinado basado en las intensidades relativas de las versiones oxidadas y no oxidadas de ese péptido. Al comparar esta huella oxidativa de la misma proteína obtenida en diferentes condiciones de conformacional (por ejemplo, ligando frente frente frente a ligando libre), las diferencias en la cantidad de oxidación de una región determinada de la proteína pueden correlacionarse directamente con las diferencias en la superficie accesible al disolvente de esa región6,,7. La capacidad de proporcionar información topográfica de proteínas hace de FPOP una tecnología atractiva para la determinación de la estructura de orden superior de las proteínas, incluso en el descubrimiento terapéutico proteico y el desarrollo10,,11.
Figura 1: Visión general de FPOP. La superficie de la proteína es modificada covalentemente por radicales hidroxilo altamente reactivos. Los radicales hidroxilo reaccionarán con las cadenas laterales de aminoácidos de la proteína a una velocidad fuertemente influenciada por la accesibilidad del disolvente de la cadena lateral. Los cambios topográficos (por ejemplo, debido a la unión de un ligando como se muestra arriba) protegerán los aminoácidos en la región de interacción de reaccionar con radicales hidroxilo, lo que resulta en una disminución en la intensidad del péptido modificado en la señal LC-MS. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Diferentes componentes presentes en la solución FPOP (por ejemplo, ligandos, excipientes, tampones) tienen diferente actividad de barrido hacia los radicales hidroxilo generados sobre la fotólisis láser de peróxido de hidrógeno3. Del mismo modo, un pequeño cambio en la concentración de peróxido, la fluencia láser y la composición del tampón puede cambiar la dosis radical efectiva, haciendo que la reproducción de datos FPOP sea un reto entre las muestras y entre diferentes laboratorios. Por lo tanto, es importante poder comparar la dosis radical hidroxilo disponible para reaccionar con la proteína en cada muestra utilizando uno de los varios dosímetros radicales hidroxilo disponibles12,13,14,15,16. Los dosímetros radicales hidroxilo actúan compitiendo con el analito (y con todos los carroñeros en solución) para la piscina de radicales hidroxilo; la dosis efectiva de los radicales hidroxilo se mide midiendo la cantidad de oxidación del dosímetro. Tenga en cuenta que “dosis radical hidroxilo eficaz” es una función tanto de la concentración inicial de hidroxilo radical generado y la vida media del radical. Estos dos parámetros dependen parcialmente entre sí, haciendo que el modelado cinético teórico sea algo complejo(Figura 2). Dos muestras podrían tener vida media radical inicial muy diferente mientras se mantiene la misma dosis radical efectiva cambiando la concentración inicial de hidroxilo radical formado; seguirán generando huellas idénticas17. Adenina13 y Tris12 son convenientes dosímetros radicales hidroxilo porque su nivel de oxidación se puede medir por espectroscopia UV en tiempo real, lo que permite a los investigadores identificar rápidamente cuando hay un problema con la dosis efectiva de radical hidroxilo y para solucionar su problema. Para resolver este problema, es importante un dosímetro en línea ubicado en el sistema de flujo directamente después del sitio de irradiación que puede monitorear la señal de los cambios de absorbancia de la adenina en tiempo real. Esto ayuda a llevar a cabo experimentos FPOP en amortiguadores o cualquier otro excipiente con niveles ampliamente diferentes de capacidad de barrido radical hidroxilo17. Esta compensación de dosis radical se puede realizar en tiempo real, dando resultados estadísticamente indistinguibles para el mismo conformerlo mediante el ajuste de la dosis radical efectiva.
En este protocolo, tenemos procedimientos detallados para realizar un experimento típico de FPOP con compensación de dosificación radical utilizando adenina como un dosímetro radical óptico interno. Este método permite a los investigadores comparar huellas entre condiciones FPOP que tienen diferente capacidad de barrido mediante la realización de compensación en tiempo real.
Figura 2: Simulación cinética de la compensación basada en la dosimetría. La respuesta del dosímetro de adenina de 1 mM se mide en un analito de cilima de 5 mM con una concentración inicial de 1 mM de «1 mM” en un sensor radical hidroxilo inicial (▪OH t1/2a53 ns) y se establece como respuesta del dosímetro objetivo (negro). Tras la adición de 1 mM de la histidina excipiente carroñera, la respuesta del dosímetro (azul) disminuye junto con la cantidad de oxidación de proteínas de manera proporcional (cian). La vida media del radical hidroxilo también disminuye (▪OH t1/2a39 ns). Cuando la cantidad de radical hidroxilo generado se incrementa para dar un rendimiento equivalente de dosímetro oxidado en la muestra con 1 mM histidina carroñero como se logra con 1 mM de radical hidroxilo en ausencia de carroñero (rojo), la cantidad de oxidación de proteína que se produce de forma similar se convierte en idéntica (magenta), mientras que la vida media radical hidroxilo disminuye aún más (▪OH t1/2=ns). Adaptado con permiso de Sharp J.S., Am Pharmaceut Rev 22, 50-55, 2019. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Las técnicas estructurales basadas en espectrometría de masas, incluyendo el intercambio de hidrógeno-deuterio, la reticulación química, el etiquetado covalente y la espectrometría de masas de pulverización nativa y la movilidad de iones han crecido rápidamente en popularidad debido a su flexibilidad, sensibilidad y capacidad para manejar mezclas complejas. FPOP cuenta con varias ventajas que han aumentado su popularidad en el área de técnicas estructurales basadas en espectrometría de masas. Al igual que la m…
The authors have nothing to disclose.
Reconocemos la financiación de investigación del Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales subvención R43GM125420-01 para apoyar el desarrollo comercial de un dispositivo FPOP de sobremesa y R01GM127267 para el desarrollo de protocolos de estandarización y dosimetría para FPOP de alta energía.
Adenine | Acros Organics | 147440250 | Soluble in water upto 3.5 mM |
Aperture | Edmund Optics | 39-905 | 1000 μm Aperture Diameter, Gold-Plated Copper Aperture |
Aperture holder | Edmund Optics | 53-287 | 25.8mm Outer Diameter, Precision Pinhole Mount |
Catalse | Sigma Aldrich | C-40 | Catalase from bovine liver, lyophilized powder, ≥10,000 units/mg protein |
COMPex Pro laser | Coherent | 1113836 | COMPexPRO 102, F-Vversion, KrF laser, No XeCl |
Dithiotheitol (DTT) | Promega | V3151 | DTT, Molecular Grade (DL-Dithiothreitol) |
Fraction collector | GenNext Technologies, Inc. | N/A | Automated fraction collector |
Fused silica capillay | Molex | 1068150023 | Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 100 µm, Outer Diameter 375 µm, TSP100375 |
Glutamine | Acros Organics | 119951000 | L(+)-Glutamine, 99% |
Holder for lens | Edmund Optics | 03-668 | 53 mm Outer Diameter, Three-Screw Adjustable Ring Mount |
Hydrogen peroxide | Fisher Scientific | H325-100 | Hydrogen Peroxide, 30% (Certified ACS), Fisher Chemical |
LC-MS/MS system | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBCX | Dionex Ultimate 3000 coupled to Orbitap Fusion Tribrid mass spectrometer |
Mas spec grade Acetonitrile | Fisher Scientific | A955-1 | Acetonitrile, Optima LC/MS Grade, Fisher Chemical |
Mass spec grade formic acid | Fisher Scientific | A117-50 | Formic Acid, 99.0+%, Optima™ LC/MS Grade, Fisher Chemical |
Mass spec grade water | Fisher Scientific | W6-4 | Water, Optima LC/MS Grade, Fisher Chemical |
MES buffer | Sigma Aldrich | M0164 | MES hemisodium salt |
Methionine amide | Bachem | 4000594.0005 | H-met-NH2.HCl |
Micro V clamp | Thor Labs | VK250 | Micro V-clamp with stainless steel blades |
Motorized stage | Edmund Optics | 68-638 | 50mm Travel Motorized Stage System with Manual Control |
Nano C18 colum | Thermo Scientific | 164534 | Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Columns |
Optical bench | Edmund Optics | 56-935 | 18" x 18" breadboard |
Pioneer FPOP Module System | GenNext Technologies, Inc. | N/A | Inline FPOP Radical Dosimetry System |
Post holder | Edmund Optics | 58-979 | 3" Length, ¼-20 Thread, Post Holder |
Sodium phosphate dibasic | Fisher Scientific | BP331-500 | Sodium Phosphate Dibasic Heptahydrate (Colorless-to-White Crystals), Fisher BioReagents |
Sodium phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP330-500 | Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate (Colorless-to-white Crystals), Fisher BioReagents |
Syringe | Hamilton | 81065 | 100 µL, Model 1710 RN SYR, Small Removable NDL, 22s ga, 2 in, point style 3 |
Syringe pump | KD Scientific | 788101 | Legato 101 syringe pump |
Trap C18 column | Thermo Scientific | 160454 | Thermo Scientific Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Columns |
Tris | Sigma Aldrich | 252859 | Tris(hydroxymethyl)aminomethane |
Trypsin | Promega | V5111 | Sequencing Grade Modified Trypsin |
UV plano convex lens | Edmund Optics | 84-285 | 30 mm Dia. x 120 mm FL Uncoated, UV Plano-Convex Lens |