Die schnelle photochemische Oxidation von Proteinen ist eine aufkommende Technik zur strukturellen Charakterisierung von Proteinen. Verschiedene Lösungsmittelzusätze und Liganden haben unterschiedliche Hydroxyl-Radikal-Aufräumeigenschaften. Um die Proteinstruktur unter verschiedenen Bedingungen zu vergleichen, ist eine Echtzeitkompensation von Hydroxylradikalen, die in der Reaktion erzeugt werden, erforderlich, um die Reaktionsbedingungen zu normalisieren.
Die schnelle photochemische Oxidation von Proteinen (FPOP) ist eine strukturbiologische Massenspektrometrie-Technik, die die lösungsmittelzugängliche Oberfläche von Proteinen untersucht. Diese Technik beruht auf der Reaktion von Aminosäure-Seitenketten mit Hydroxylradikalen, die sich frei in Lösung diffundieren. FPOP erzeugt diese Radikale in situ durch Laserphotolyse von Wasserstoffperoxid, wodurch ein Ausbruch von Hydroxylradikalen entsteht, der in der Größenordnung von einer Mikrosekunde erschöpft ist. Wenn diese Hydroxylradikale mit einer lösungsmittelzugänglichen Aminosäure-Seitenkette reagieren, weisen die Reaktionsprodukte eine Massenverschiebung auf, die durch Massenspektrometrie gemessen und quantifiziert werden kann. Da die Reaktionsgeschwindigkeit einer Aminosäure zum Teil von der durchschnittlichen lösungsmittelzugänglichen Oberfläche dieser Aminosäure abhängt, können gemessene Veränderungen der Oxidationsmenge einer bestimmten Region eines Proteins direkt mit Veränderungen der Lösungsmittelzugänglichkeit dieser Region zwischen verschiedenen Konformationen korreliert werden (z. B. Liganden gebunden versus Ligandenfrei, Monomer vs. Aggregat usw.). FPOP wurde in einer Reihe von Problemen in der Biologie angewendet, einschließlich Protein-Protein-Wechselwirkungen, Protein-Konformationsänderungen, und Protein-Ligand-Bindung. Da die verfügbare Konzentration von Hydroxylradikalen aufgrund vieler experimenteller Bedingungen im FPOP-Experiment variiert, ist es wichtig, die effektive Radikaldosis zu überwachen, der das Proteinanalyt ausgesetzt ist. Diese Überwachung wird effizient durch die Einbindung eines Inline-Dosimeters zur Messung des Signals aus der FPOP-Reaktion erreicht, wobei der Laserflonin in Echtzeit angepasst wird, um die gewünschte Oxidationsmenge zu erreichen. Mit dieser Kompensation können Veränderungen in der Proteintopographie, die Konformationsveränderungen, Ligandenbindungsflächen und/oder Protein-Protein-Interaktionsschnittstellen widerspiegeln, in heterogenen Proben mit relativ geringen Probenmengen bestimmt werden.
Die schnelle photochemische Oxidation von Proteinen (FPOP) ist eine aufkommende Technik zur Bestimmung topografischer Proteinveränderungen durch ultraschnelle kovalente Modifikation der lösungsmittelexponierten Oberfläche von Proteinen, gefolgt von der Detektion durch LC-MS1. FPOP erzeugt eine hohe Konzentration von Hydroxylradikalen in situ durch UV-Laserblitzphotolyse von Wasserstoffperoxid. Diese Hydroxylradikale sind sehr reaktiv und kurzlebig, verbraucht auf etwa einer Mikrosekunde Zeitskala unter FPOP-Bedingungen2. Diese Hydroxylradikale diffundieren durch Wasser und oxidieren verschiedene organische Komponenten in Lösung mit kinetischen Raten im Allgemeinen von schnell (-106 M-1 s-1) bis zu diffusionskontrolliert3. Wenn das Hydroxylradikal auf eine Proteinoberfläche trifft, oxidiert der Radikal die Aminosäure-Seitenketten auf der Proteinoberfläche, was zu einer Massenverschiebung dieser Aminosäure (am häufigsten die Nettozugabe eines Sauerstoffatoms)4. Die Geschwindigkeit der Oxidationsreaktion bei jeder Aminosäure hängt von zwei Faktoren ab: der inhärenten Reaktivität dieser Aminosäure (die von der Seitenkette und dem Sequenzkontext abhängt)4,5 und der Zugänglichkeit dieser Seitenkette zum diffundierenden Hydroxylradikal, die eng mit der durchschnittlichen lösungsmittelzugänglichen Oberfläche6,7korreliert. Alle Standard-Aminosäuren mit Ausnahme von Glycin wurden von diesen hochreaktiven Hydroxylradikalen in FPOP-Experimenten als gekennzeichnet beobachtet, wenn auch mit sehr unterschiedlichen Erträgen; in der Praxis werden Ser, Thr, Asn und Ala in den meisten Proben nur unter hohen radikalen Dosen oxidiert und durch sorgfältige und empfindliche gezielte ETD-Fragmentierungidentifiziert 8,9. Nach der Oxidation werden Proben abgeschreckt, um Wasserstoffperoxid und sekundäre Oxidationsmittel (Superoxid, Singlet-Sauerstoff, Peptidylhydroperoxide usw.) zu entfernen. Die abgeschreckten Proben werden dann proteolytisch verdaut, um Mischungen von oxidierten Peptiden zu erzeugen, wobei die Strukturinformationen als chemischer “Schnappschuss” in den Mustern der Oxidationsprodukte der verschiedenen Peptide eingefroren werden (Abbildung 1). Flüssigkeitschromatographie gekoppelt an Massenspektrometrie (LC-MS) wird verwendet, um die Menge der Oxidation von Aminosäuren in einem bestimmten proteolytischen Peptid basierend auf den relativen Intensitäten der oxidierten und unoxidierten Versionen dieses Peptids zu messen. Durch den Vergleich dieses oxidativen Fußabdrucks desselben Proteins, das unter verschiedenen konformen Bedingungen (z. B. Liganden gebunden im Vergleich zu Liganden-frei) gewonnen wird, können Unterschiede in der Oxidationsmenge einer bestimmten Region des Proteins direkt mit Unterschieden in der lösungsmittelzugänglichen Oberfläche dieser Region6,7korreliert werden. Die Fähigkeit, proteintopografische Informationen zur Verfügung zu stellen, macht FPOP zu einer attraktiven Technologie für die höherrangige Strukturbestimmung von Proteinen, auch bei der proteintherapeutischen Entdeckung und Entwicklung10,11.
Abbildung 1: Übersicht über FPOP. Die Oberfläche des Proteins wird durch hochreaktive Hydroxylradikale kovalent modifiziert. Die Hydroxylradikale reagieren mit Aminosäureseitenketten des Proteins mit einer Geschwindigkeit, die stark durch die Lösemittelzugänglichkeit der Seitenkette beeinflusst wird. Topografische Veränderungen (z. B. durch die Bindung eines Liganden wie oben gezeigt) schützen Aminosäuren im Bereich der Wechselwirkung vor einer Reaktion mit Hydroxylradikalen, was zu einer Abnahme der Intensität des modifizierten Peptids im LC-MS-Signal führt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Verschiedene Bestandteile der FPOP-Lösung (z.B. Liganden, Hilfsstoffe, Puffer) haben unterschiedliche Aufräumaktivitäten gegenüber den Hydroxylradikalen, die bei der Laserphotolyse von Wasserstoffperoxid3erzeugt werden. In ähnlicher Weise kann eine kleine Änderung der Peroxidkonzentration, des Lasereinflusses und der Pufferzusammensetzung die effektive Radikaldosis verändern, was die Reproduktion von FPOP-Daten in den Proben und zwischen verschiedenen Labors zu einer Herausforderung macht. Daher ist es wichtig, die verfügbare Hydroxyl-Radikaldosis mit Protein in jeder Probe mit einem von mehreren verfügbaren Hydroxylradikaldosimetern12,,13,,14,15,16zu vergleichen. Hydroxyl-Radikal-Dosimeter wirken, indem sie mit dem Analyten (und mit allen Scavengern in Lösung) für den Pool von Hydroxylradikalen konkurrieren; die effektive Dosis von Hydroxylradikalen wird durch Messung der Oxidationsmenge des Dosimeters gemessen. Beachten Sie, dass “effektive Hydroxyl-Radikal-Dosis” ist eine Funktion sowohl der anfänglichen Konzentration von Hydroxyl-Radikal erzeugt und die Halbwertszeit des Radikals. Diese beiden Parameter sind teilweise voneinander abhängig, was die theoretische kinetische Modellierung etwas komplex macht (Abbildung 2). Zwei Proben könnten völlig unterschiedliche anfängliche radikale Halbwertszeiten haben, während sie immer noch die gleiche effektive radikale Dosis beibehalten, indem sie die anfängliche Konzentration von Hydroxylradikal gebildet ändern; sie erzeugen immer noch identische Fußabdrücke17. Adenin13 und Tris12 sind praktische Hydroxylradikal-Dosimeter, da ihr Oxidationsgrad durch UV-Spektroskopie in Echtzeit gemessen werden kann, so dass Forscher schnell erkennen können, wenn es ein Problem mit einer wirksamen Hydroxylradikaldosis gibt, und ihr Problem beheben können. Um dieses Problem zu lösen, ist ein Inline-Dosimeter im Strömungssystem direkt nach dem Bestrahlungsort wichtig, das das Signal von Adenin-Absorptionsänderungen in Echtzeit überwachen kann. Dies hilft bei der Durchführung von FPOP-Experimenten in Puffern oder anderen Hilfsstoffen mit sehr unterschiedlichen Konzentrationen von Hydroxyl-Radikal-Aufräumkapazität17. Diese radikale Dosierungskompensation kann in Echtzeit durchgeführt werden, was statistisch nicht unterscheidbare Ergebnisse für den gleichen Conformer ergibt, indem die effektive Radikaldosis angepasst wird.
In diesem Protokoll haben wir detaillierte Verfahren für die Durchführung eines typischen FPOP-Experiments mit radikaler Dosierungskompensation mit Adenin als internes optisches Radikaldosimeter. Diese Methode ermöglicht es den Forschern, Footprints über FPOP-Bedingungen hinweg zu vergleichen, die unterschiedliche Aufräumkapazitäten haben, indem sie eine Kompensation in Echtzeit durchführen.
Abbildung 2: Kinetische Simulation der dosimetriebasierten Kompensation. 1 mM Adenin-Dosimeter-Antwort wird in 5 ‘M Lysozym-Analyt mit einer anfänglichen Hydroxyl-Radikalkonzentration von 1 mM (▪OH t1/2=53 ns) gemessen und als Zieldosimeter-Antwort (schwarz) eingestellt. Nach Zugabe von 1 mM des Abräumers Excipient Histidin nimmt die Dosimeterreaktion (blau) zusammen mit der Menge der Proteinoxidation proportional ab (Cyan). Die Halbwertszeit des Hydroxylradikals nimmt ebenfalls ab (▪OH t1/2=39 ns). Wenn die Menge an Hydroxylradikal erhöht wird, um eine gleichwertige Ausbeute an oxidiertem Dosimeter in der Probe mit 1 mM Histidinfänger zu geben, wie mit 1 mM Hydroxylradikal in Abwesenheit von Scavenger (rot) erreicht, wird die Menge der Proteinoxidation, die ähnlich auftritt, identisch (Magenta), während die Halbwertszeit des Hydroxylradikals noch weiter abnimmt (▪OH t1/2=29 ns). Angepasst mit Genehmigung von Sharp J.S., Am Pharmaceut Rev 22, 50-55, 2019. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Massenspektrometrie-basierte Strukturtechniken, einschließlich Wasserstoff-Deuterium-Austausch, chemische Vernetzung, kovalente Etikettierung und native Sprühmassenspektrometrie und Ionenmobilität, haben aufgrund ihrer Flexibilität, Empfindlichkeit und Fähigkeit, mit komplexen Mischungen umzugehen, rapide an Popularität gewonnen. FPOP verfügt über mehrere Vorteile, die seine Popularität im Bereich der Massenspektrometrie-basierten Strukturtechniken erhöht hat. Wie die meisten kovalenten Etikettierungsstrategien…
The authors have nothing to disclose.
Wir würdigen forschungsmittel vom National Institute of General Medical Sciences Grant R43GM125420-01zur Unterstützung der kommerziellen Entwicklung eines FPOP-Tischgeräts und R01GM127267 für die Entwicklung von Standardisierungs- und Dosimetrieprotokollen für Hochenergie-FPOP.
Adenine | Acros Organics | 147440250 | Soluble in water upto 3.5 mM |
Aperture | Edmund Optics | 39-905 | 1000 μm Aperture Diameter, Gold-Plated Copper Aperture |
Aperture holder | Edmund Optics | 53-287 | 25.8mm Outer Diameter, Precision Pinhole Mount |
Catalse | Sigma Aldrich | C-40 | Catalase from bovine liver, lyophilized powder, ≥10,000 units/mg protein |
COMPex Pro laser | Coherent | 1113836 | COMPexPRO 102, F-Vversion, KrF laser, No XeCl |
Dithiotheitol (DTT) | Promega | V3151 | DTT, Molecular Grade (DL-Dithiothreitol) |
Fraction collector | GenNext Technologies, Inc. | N/A | Automated fraction collector |
Fused silica capillay | Molex | 1068150023 | Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 100 µm, Outer Diameter 375 µm, TSP100375 |
Glutamine | Acros Organics | 119951000 | L(+)-Glutamine, 99% |
Holder for lens | Edmund Optics | 03-668 | 53 mm Outer Diameter, Three-Screw Adjustable Ring Mount |
Hydrogen peroxide | Fisher Scientific | H325-100 | Hydrogen Peroxide, 30% (Certified ACS), Fisher Chemical |
LC-MS/MS system | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBCX | Dionex Ultimate 3000 coupled to Orbitap Fusion Tribrid mass spectrometer |
Mas spec grade Acetonitrile | Fisher Scientific | A955-1 | Acetonitrile, Optima LC/MS Grade, Fisher Chemical |
Mass spec grade formic acid | Fisher Scientific | A117-50 | Formic Acid, 99.0+%, Optima™ LC/MS Grade, Fisher Chemical |
Mass spec grade water | Fisher Scientific | W6-4 | Water, Optima LC/MS Grade, Fisher Chemical |
MES buffer | Sigma Aldrich | M0164 | MES hemisodium salt |
Methionine amide | Bachem | 4000594.0005 | H-met-NH2.HCl |
Micro V clamp | Thor Labs | VK250 | Micro V-clamp with stainless steel blades |
Motorized stage | Edmund Optics | 68-638 | 50mm Travel Motorized Stage System with Manual Control |
Nano C18 colum | Thermo Scientific | 164534 | Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Columns |
Optical bench | Edmund Optics | 56-935 | 18" x 18" breadboard |
Pioneer FPOP Module System | GenNext Technologies, Inc. | N/A | Inline FPOP Radical Dosimetry System |
Post holder | Edmund Optics | 58-979 | 3" Length, ¼-20 Thread, Post Holder |
Sodium phosphate dibasic | Fisher Scientific | BP331-500 | Sodium Phosphate Dibasic Heptahydrate (Colorless-to-White Crystals), Fisher BioReagents |
Sodium phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP330-500 | Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate (Colorless-to-white Crystals), Fisher BioReagents |
Syringe | Hamilton | 81065 | 100 µL, Model 1710 RN SYR, Small Removable NDL, 22s ga, 2 in, point style 3 |
Syringe pump | KD Scientific | 788101 | Legato 101 syringe pump |
Trap C18 column | Thermo Scientific | 160454 | Thermo Scientific Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Columns |
Tris | Sigma Aldrich | 252859 | Tris(hydroxymethyl)aminomethane |
Trypsin | Promega | V5111 | Sequencing Grade Modified Trypsin |
UV plano convex lens | Edmund Optics | 84-285 | 30 mm Dia. x 120 mm FL Uncoated, UV Plano-Convex Lens |