Este protocolo visa descrever passo a passo a técnica de extração e avaliação da função cardíaca utilizando cardiomiócitos esfolados. Esta metodologia permite a medição e a sintomadulação aguda da função de miofilament usando pequenas biópsias congeladas que podem ser coletadas de diferentes locais cardíacos, de camundongos a homens.
Neste artigo, descrevemos as etapas necessárias para isolar um único cardiomiócito permeabilizado (“esfolado”) e anexá-lo a um aparelho de medição de força e a um motor para realizar estudos funcionais. Esses estudos permitirão a medição da rigidez cardiomiócito (força passiva) e sua ativação com diferentes soluções contendo cálcio (Ca2+)-contendo soluções para determinar, entre outros: desenvolvimento de força máxima, miofilação Ca2+-sensibilidade (pCa50),cooperatividade (nHill) e taxa de redesenvolvimento da força (ktr). Este método também permite a determinação dos efeitos das drogas que atuam diretamente nos miofilamentos e na expressão de proteínas recombinantes exógenas em propriedades ativas e passivas de cardiomiócitos. Clinicamente, estudos de cardiomiócitos esfolados destacam a fisiopatologia de muitas doenças do miocárdio e permitem a avaliação in vitro do impacto das intervenções terapêuticas direcionadas aos miofilaments. Ao todo, essa técnica permite o esclarecimento da fisiopatologia cardíaca, investigando correlações entre parâmetros in vitro e in vivo em modelos animais e tecido humano obtidos durante cirurgia de coração aberto ou transplante.
Tradicionalmente, a avaliação das propriedades mecânicas do miocárdio tem sido tentada principalmente em preparações multicelulares, como músculos papilares e trabeculas1,2. As tiras de músculos cardíacos multicelulares incluem uma população heterogênea de células, incluindo cardiomiócitos contílicos com um padrão desconhecido de orientação e geração de força, atividade elétrica e distribuições de estresse/tensão, bem como uma matriz de tecido conjuntivo circundante3,4. Uma preparação sem colágeno e contendo um único cardiomiócito permitiria a medição do comprimento sarcomere e propriedades contíteis de ponte transversal de forma muito precisa e controlada5,6. Portanto, ao longo das últimas quatro décadas, foram desenvolvidas diversas metodologias permitindo a investigação das propriedades mecânicas, contratuais e de relaxamento de um único cardiomiócito6,7. A função contractile dessas células é fortemente dependente do comprimento sarcomere e cinética de ciclismo de ponte cruzada3. Assim, é desejável investigar a função muscular diretamente em células cardíacas isoladas únicas, considerando que permite avaliar o comprimento e o desempenho do sarcomere, bem como a função transfronteiriço e propriedades contratuais. No entanto, isolar e anexar cardiomiócitos funcionais com uma resolução óptica razoável de sarcomere, enquanto a medição da força de gravação no nível de μN ainda é desafiadora e emevolução 3,6. Outros desafios são a logística que precisa ser instalada para isolar cardiomiócitos de biópsias recém-coletadas. A imprevisibilidade da coleta de biópsias humanas, por exemplo, pode comprometer a viabilidade dos experimentos.
Além disso, preocupações éticas quanto à Substituição, Redução e Refinamento da experimentação animal para procedimentos científicos (princípios dos 3Rs) promoveram mudanças de estudo no nível celular e tecidual, preferencialmente em biópsias humanas, ou em amostras de animais menores. De fato, um refinamento progressivo das metodologias para avaliar a função cardíaca in vitro em um nível menor de complexidade permite a integração adequada dos resultados para todo o corpo e traduzi-los para o cenário clínico7. Ao todo, o uso de amostras armazenadas a -80 °C para extrair cardiomiócitos pode ser uma alternativa atraente.
O tecido miocárdio é cortado em pequenos pedaços e homogeneizado com uma argamassa e um pilão. O resultado dessa homogeneização é a suspensão de células empacotadas e isoladas com diferentes graus de dano sarcolemmal, em que o mioplasma é exposto ao meio de banho e todos os componentes celulares são lavados. Estruturas como os miofibrils que estão mais distantes do sarcolemma são preservadas. Assim, o encurtamento sarcomere e as propriedades funcionais associadas ao aparelho miofibrilar são mantidos intactos e podem ser registrados8,9.
O sistema de medição da força cardiomiocócica consiste em um motor eletromagnético, usado para ajustar o comprimento do cardiomiócito, e um transdutor de força, que mede a contração do cardiomiócito isométrico. Um cardiomiócito permeabilizado, ou esfolado, é colocado em uma câmara experimental contendo uma solução relaxante ([Ca2+] < 10 nM) e colado em silício a 2 agulhas finas: uma presa ao motor e outra ao transdutor de força. Um sistema óptico é usado para determinar a morfologia cardiomiócito e o comprimento do sarcomere. O protocolo experimental muitas vezes consiste em uma série de gravações de força sobre soluções tampão contendo diferentes concentrações de Ca2+, a determinação da cinética transversal actin-myosin e a medição da tensão passiva dos cardiomiócitos montados em comprimentos de sarcomere pré-definidos(Figura 1). Isolamento de cardiomiócitos permeabilizados de amostras de miocárdio congelados em nitrogênio líquido (e posteriormente armazenados a -80 °C) é uma técnica que utiliza mecânica celular e bioquímica proteica para medir força máxima Ca2+ativada (ativa) por área transversal (Tativa, kN∙m-2), Ca2 2+-tensão independente (passiva) (Tpassiva, kN∙m-2), mistilaments Ca2+-sensibilidade (pCa50),cooperatividade myofilaments (nHill), taxa de redesenvolvimento de força (ktr) bem como dependências de comprimento sarcomere de Tativo,T passivo, pCa50, nHill e ktr.
O objetivo deste protocolo é ilustrar e resumir o potencial do sistema de medição da força cardiomiocócica como um procedimento confiável para avaliar as propriedades mecânicas funcionais de cardiomiócitos de pele única isolados de amostras congeladas de diferentes espécies.
A avaliação in vitro da função cardíaca utilizando cardiomiócitos esfolados representa uma técnica importante para esclarecer as modificações ocorridas ao nível de cardiomiócitos no contexto fisiológico (por exemplo, alongamento) e patológico (por exemplo, isquemia). Essa metodologia possui diversas vantagens, como a exigência de uma quantidade mínima de miocárdio para avaliar a função em cardiomiócitos obtidos a partir de amostras descongeladas; utilizando cardiomiócitos de uma ampla gama de espécies (camundongos13, rato1,14,15, coelho16, porco17, cão18, cobaia19 e humano20) e diferentes locais cardíacos, incluindo os átrios, ventrículos esquerdo e direito ou uma região específica do coração infartado. Além disso, essa técnica permite fornecer concentrações específicas de Ca2+ e energia (ATP) ao medir a função de estruturas regulatórias e contratuais em sua configuração nativa.
Apesar da simplicidade dessa técnica, existem alguns passos críticos. É essencial garantir a qualidade de cada passo desde o início, incluindo a coleta de amostras. As proteínas de miofilamento são suscetíveis às proteases21. Assim, é obrigatório armazenar amostras em nitrogênio líquido imediatamente após sua coleta. Amostras frescas, que não foram previamente congeladas, desenvolverão forças significativamente maiores, por isso não é aconselhável misturar a medição feita em amostras frescas e congeladas no mesmo protocolo. O segundo passo mais crítico é a extração dos cardiomiócitos. Durante este procedimento, é crucial manter a amostra no gelo na maior parte do tempo. Um coquetel inibidor de protease pode ser usado para reduzir o risco de degradação proteica durante a extração/permeabilização22. Em terceiro lugar, as amostras devem ser cortadas em pedaços menores usando movimentos precisos do bisturi, uma vez que notamos cardiomiócitos de qualidade reduzida quando esta etapa foi desconsiderada. Outro passo crítico é lavar os cardiomiócitos, pois é difícil ter o equilíbrio certo entre lavar Tritão (permeabilize a célula, mas promove sua descolagem) e manter o maior número possível de células no sobrenante. É importante primeiro experimentar a extração e o número de lavagens para cada amostra, espécie ou protocolo. Por exemplo, em nossas mãos, notamos que as extrações de tecido de rato obeso ZSF1 têm um aspecto “gorduroso”, o que tornou essas células mais escorregadias durante a colagem, mas não mais difíceis de medir. A maneira como contornamos esse problema foi realizando mais experimentos para ter um número razoável de células por animal. Além disso, é crucial selecionar uma boa célula para colar, ou seja, com boa estriação e comprimento razoável. Se o cardiomiócito não tiver essas características, ele se desprenderá principalmente das pontas da agulha ou desenvolverá nenhuma/baixa força. Também é importante usar a cola correta para fixação de cardiomiócito, considerando o tempo de colagem e sua eficácia para colar a célula à agulha. Em nossas mãos, a cola de silicone(Tabela de Materiais)cura rápido (10-15 min) e forte o suficiente. Finalmente, o último passo crítico está relacionado com o levantamento cuidadoso do cardiomiócito 5 minutos depois de colar a célula (para evitar colar a célula no deslizamento) e antes de movê-la para os poços (para evitar que a célula seja arrastada pelo estágio do microscópio). A Tabela 7 resume a solução de problemas associada a essa técnica, suas causas subjacentes e possíveis soluções para superar problemas frequentes.
A maior limitação deste método é que ele não pode responder a todas as questões relacionadas à contratilidade do miofilament, como a rapidez com que os miofilamentos ativam/desativam. No cenário in vivo, a despolarização da membrana, o aumento intracelular ca2+ e sua difusão aos miofilamentos precisam ocorrer para que os miócitos se contraam, enquanto nos cardiomiócitos esfolados Ca2+ a difusão aos miofilamentos ocorre imediatamente quando a célula está submersa na solução Ca2+. Esta taxa mais rápida de difusão de Ca2+ influenciará a análise de ativação/desativação de myofilaments23.
Esses experimentos são influenciados por diferentes fatores, incluindo temperatura, pH de solução, perturbação mecânica (slack-re-stretch vs. slack) e procedimentos de fixação celular (pin tie vs. cola), todas essas variáveis que contabilizam discrepâncias na literatura em termos de ktr e o aumento de sarcomere dependente de comprimento em força4,12.
O progresso futuro da técnica inclui a realização de estudos funcionais em cardiomiócitos intactos e não permeabilizados. Esta técnica tem a desvantagem de depender de cardiomiócitos recém-isolados (não previamente congelados). Outra questão importante não está diretamente relacionada a essa metodologia, mas que pode impactar significativamente está relacionada ao período máximo de armazenamento congelado da amostra. Especificamente, é obrigatório estabelecer o grau de degradação do miofilamento durante todo o tempo de armazenamento (ou seja, por quanto tempo as amostras congeladas podem ser armazenadas para garantir dados funcionais de boa qualidade derivados dos cardiomiócitos extraídos).
The authors have nothing to disclose.
Os autores agradecem à Fundação Portuguesa de Ciência e Tecnologia (FCT), União Europeia, Quadro de Referência Estratégica Nacional (QREN), Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) e Programa Operacional Factores de Competitividade (COMPETE) pelo financiamento da unidade de pesquisa da UnIC (UID/IC/00051/2013). Este projeto é apoiado pela FEDER por meio do COMPETE 2020 – Programa Operacional Competitividade E Internacionalização (POCI), projeto DOCNET (NORTE-01-0145-FEDER-000003), apoiado pelo Programa Operacional Norte Portugal (NORTE 2020), sob o acordo de parceria Portugal 2020, por meio do Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (ERDF), o projeto NETDIAMOND (POCI-01-0145-FEDER-016385), apoiado pelos Fundos Estruturais e de Investimento Europeus, programa operacional regional de Lisboa 2020. Patrícia Rodrigues foi financiada pela FCT (SFRH/BD/96026/2013) e João Almeida-Coelho foi financiada pela Universidade do Porto/FMUP e FSE-Fundo Social Europeu, NORTE 2020-Programa Operacional Regional do Norte, (NORTE-08-5369-FSE-000024-Programas Doutorais).
Acetone | Sigma | 34580 | |
Adenosine 5’-triphosphate disodium salt hydrate (Na2ATP) | Sigma | A2383 | |
Calcium carbonate (CaCO3) | Merck | 1.02067.0500 | |
Imidazole | VWR | 24720.157 | |
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2.6H2O) | Merck | 1.05833.0250 | |
Magnesium chloride solution (MgCl2 1M) | Sigma | M1028 | |
N,N-Bis(2-hydroxyethyl)taurine (BES) | Sigma | B9879 | |
Phosphocreatine dissodium salt hydrate (Na2PCr) | Sigma | P7936 | |
Potassium chloride (KCl) | Merck | 1.04936.1000 | |
Potassium hydroxide (KOH) | Merck | 8.14353.1000 | |
Propionic acid (C3H6O2) | Merck | 8.00605.0500 | |
Silicone Squeeze Tube | Marineland | 31003 | |
Tritiplex (EGTA) | Merck | 1.08435.0025 | |
Triton® X-100 10% | Merck | 648463 | |
Tissue homogeneizer (GKH GT Motor Control) | Terre Haute Glas-col | ||
Length Controller ( Model 315C-I) | Aurora Scientific | ||
Force Transducer (Model 403 A) | Aurora Scientific | ||
Software ASI 600A | Aurora Scientific | ||
Sotware VSL (Model 900B) | Aurora Scientific | ||
Inverted Microscope (IX51) | Olympus |