该协议旨在逐步描述使用皮肤心肌细胞提取和评估心脏功能的技术。这种方法允许测量和急性调节肌黄化功能使用小型冷冻活检,可以从不同的心脏位置,从小鼠到男性收集。
在这篇文章中,我们描述了分离单个渗透(”皮肤”)心肌细胞并将其连接到力测量装置和运动以进行功能研究所需的步骤。这些研究将允许测量心肌细胞刚度(被动力)及其激活与不同的钙(Ca2+)包含的解决方案,以确定,除其他外:最大力的发展,肌功能Ca2+-敏感性(pCa50),合作率(nHill)和力重建率(ktr)。这种方法还能够确定药物对肌黄细胞的作用,以及外源重组蛋白对心肌细胞的活性和被动特性的表达。临床上,皮肤心肌细胞研究突出了许多心肌疾病的病理生理学,并允许体外评估针对心肌病的治疗干预的影响。总之,这项技术通过研究动物模型中的体外和体内参数与开放心脏或移植手术中获得的人体组织中的相关性,从而能够澄清心脏病理生理学。
传统上,心肌机械性能的评估主要尝试在多细胞制剂,如心肌和脑膜1,2。多细胞心脏肌肉条包括细胞的异质群,包括具有未知方向和力生成模式的收缩性心肌细胞、电活动和应力/应变分布以及周围的结缔组织基质3、4。没有胶原蛋白和含有单个心肌细胞的制备将允许以非常精确和控制的方式测量沙康长度和跨桥收缩特性5,6。因此,在过去四十年中,开发了几种方法,允许研究单个心肌细胞6,7的机械、收缩和松弛特性。这些细胞的收缩功能强烈依赖于沙康长度和跨桥循环动力学3。因此,最好直接研究单个分离心脏细胞中的肌肉功能,因为它允许评估沙康长度和性能,以及跨桥功能和收缩特性。然而,在 +N 级别记录力测量时,以合理的光学沙康分辨率隔离和附加功能性心肌细胞仍然是具有挑战性的,并且正在演变 3,6。其他挑战是需要安装的物流,以将心肌细胞从新收集的活检中分离。例如,人类活检收集的不可预测性可能危及实验的可行性。
此外,关于科学程序(3R原则)动物实验的替换、减少和细化的伦理问题促进了细胞和组织层面的研究变化,最好是在人体活检中,或在较小的动物样本中。事实上,逐步改进的方法,以评估心脏功能在体外在较小的复杂水平允许适当的整合的结果到全身,并把它们转化为临床场景7。总之,使用储存在-80°C的样品提取心肌细胞可能是一个有吸引力的替代方案。
心肌组织被切成小块,用迫击炮和刺骨均匀化。这种均质化的结果是悬浮皮肤捆绑和分离的细胞与不同程度的肉瘤损伤,其中短质暴露在沐浴介质和所有细胞成分被冲走。结构,如肌骨,远离肉瘤被保留。因此,与 myofibrillar 仪器相关的沙康缩短和功能属性保持不变,可以记录8,9。
心肌细胞力测量系统由用于调整心肌细胞长度的电磁电机和测量等轴测心肌细胞收缩的力传感器组成。渗透或剥皮的心肌细胞被放置在一个实验室中,其中包含一个放松溶液([Ca2]& lt; 10 nM),硅粘附在2根细针上:一根连接到电机,另一根连接到力传感器。光学系统用于确定心肌细胞形态和沙康长度。实验方案通常包括一系列在缓冲溶液上进行力记录,这些缓冲溶液包含不同的Ca2+浓度,确定行为素-肌素跨桥动力学,以及测量在预定义sarcomere长度下所装心肌细胞的被动张力(图1)。从冷冻在液氮中的心肌样品中分离渗透性心肌细胞(随后储存在-80°C)是一种利用细胞力学和蛋白质生物化学测量最大Ca2+-激活(活性)力的技术(T活性,kN+m-2),Ca2°-独立(被动)张力(T被动,kN=m-2),myofilamentsCa2+-灵敏度(pCa50),myofilaments合作率(nHill),力重建率(ktr)以及T主动、T被动、pCa50、nHill和ktr的sarcome长度依赖关系。
该协议的目标是说明和总结心肌细胞力测量系统作为评估从不同物种冷冻样本中分离出的单皮心肌细胞的功能力学特性的可靠程序的潜力。
使用皮肤心肌细胞对心脏功能进行体外评估是澄清在生理(如拉伸)和病理环境中(如缺血)中发生在心肌细胞水平的修饰的重要技术。这种方法有几个优点,例如需要少量的心肌评估从解冻样品中获得的心肌细胞的功能;使用来自各种物种(小鼠13,大鼠1,14,15,兔子16,猪17,狗18,豚鼠19和人类20)和人类20)和人类20)和不同的心脏位置,包括心室,左心和右心室或梗塞心脏的特定区域。此外,该技术允许在测量调节结构和收缩结构在本机配置中的功能的同时,提供特定浓度的 Ca2+和能量 (ATP)。
尽管这种技术简单,但有一些关键步骤。从一开始就保证每个步骤的质量,包括样品收集,这一点至关重要。myofilament蛋白质易受蛋白酶21的影响。因此,在收集样品后立即将样品储存在液氮中。以前未冷冻的新鲜样品的力会显著提高,因此不建议在同一协议中混合在新鲜样品和冷冻样品中进行测量。第二个最关键的步骤是心肌细胞的提取。在此过程期间,在冰上保持样品的大部分时间都至关重要。蛋白酶抑制剂鸡尾酒可用于降低提取/渗透过程中蛋白质降解的风险。第三,样品应该削减在较小的部分使用精确的手术刀运动,因为我们注意到质量下降心肌细胞时,这一步骤被忽略。另一个关键步骤是清洗心肌细胞,因为很难在洗掉Triton(渗透细胞,但促进其脱粘)和保持尽可能多的细胞在上一代之间保持正确的平衡。重要的是首先尝试每个样品,物种或协议的抽取和洗涤数量。例如,在我们的手中,我们注意到ZSF1肥胖大鼠组织提取有一个”脂肪”方面,这使得这些细胞在粘合过程中更滑,但不难测量。我们绕过这个问题的方法是进行更多的实验,让每只动物拥有合理数量的细胞。此外,选择良好的细胞粘附,即具有良好的条纹和合理的长度,是至关重要的。如果心肌细胞没有这些功能,它大多会脱离针尖或发展无/低力。考虑到粘合的时间及其将细胞粘到针头的功效,使用正确的胶水进行心肌细胞附着也很重要。在我们手中, 硅胶胶 ( 材料表 )固化快 (10-15 分钟) 和足够强.最后,最后一个关键步骤与在粘合细胞后 5 分钟小心地抬起心肌细胞(避免将细胞粘合到盖玻片)和移动到孔之前(避免细胞被显微镜阶段拖动有关)。 表 7 总结了与此技术相关的故障排除、其根本原因以及克服常见问题的可能解决方案。
这种方法的主要限制是,它不能回答与 myofilament 收缩相关的所有问题,例如 imofilament 激活/停用的速度。在体内设置中,膜去极化,细胞内 Ca2+ 增加,其扩散到肌黄体需要发生,使肌细胞收缩,而在皮肤心肌细胞 Ca2+扩散到肌黄体时,当细胞被淹没在Ca2+ 溶液中时,立即发生。这种更快的Ca2+扩散速度将偏向我的失物激活/停用分析23。
这些实验受不同因素的影响,包括温度、溶液pH值、机械扰动(松弛-再拉伸与松弛)和细胞附着程序(针扎与胶水),所有这些变量都考虑到ktr和沙康长度依赖力4、12的相数差异。
该技术的未来进展包括进行功能研究,在完好无损,而不是渗透心肌细胞。这种技术缺点是依靠新鲜分离的心肌细胞(以前没有冷冻)。另一个与这种方法没有直接关系但可能严重影响它的重要问题与样品冷冻储存的最大期限有关。具体来说,必须确定整个储存时间(即冷冻样品的储存时间),以确保从提取的心肌细胞中提取的高质量功能数据)。
The authors have nothing to disclose.
作者感谢葡萄牙科学和技术基金会、欧洲联盟、国家环境研究所、欧洲区域科学基金会和竞争方案(COMPETE),为统一国际中心(UID/IC/00051/2013)研究单位提供资金。该项目由联邦贸易部通过竞争2020年支持 – 国际合作方案(POCI),项目DOCNET(NORTE-01-0145-FEDER-000003),由北葡萄牙区域业务方案(NORTE 2020)根据葡萄牙2020年伙伴关系协定支持, 通过欧洲区域发展基金(ERDF),NETDIAMOND项目(POCI-01-0145-FEDER-016385),由里斯本2020年区域业务项目欧洲结构和投资基金支持。Patrécia Rodrigues由FCT(SFRH/BD/96026/2013)资助,若昂·阿尔梅达-科埃略由波尔图大学/FMUP和FSE-Fundo欧洲社会大学资助, NOR 2020-计划地区多特,(NORTE-08-5369-FSE-000024-程序杜托莱。
Acetone | Sigma | 34580 | |
Adenosine 5’-triphosphate disodium salt hydrate (Na2ATP) | Sigma | A2383 | |
Calcium carbonate (CaCO3) | Merck | 1.02067.0500 | |
Imidazole | VWR | 24720.157 | |
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2.6H2O) | Merck | 1.05833.0250 | |
Magnesium chloride solution (MgCl2 1M) | Sigma | M1028 | |
N,N-Bis(2-hydroxyethyl)taurine (BES) | Sigma | B9879 | |
Phosphocreatine dissodium salt hydrate (Na2PCr) | Sigma | P7936 | |
Potassium chloride (KCl) | Merck | 1.04936.1000 | |
Potassium hydroxide (KOH) | Merck | 8.14353.1000 | |
Propionic acid (C3H6O2) | Merck | 8.00605.0500 | |
Silicone Squeeze Tube | Marineland | 31003 | |
Tritiplex (EGTA) | Merck | 1.08435.0025 | |
Triton® X-100 10% | Merck | 648463 | |
Tissue homogeneizer (GKH GT Motor Control) | Terre Haute Glas-col | ||
Length Controller ( Model 315C-I) | Aurora Scientific | ||
Force Transducer (Model 403 A) | Aurora Scientific | ||
Software ASI 600A | Aurora Scientific | ||
Sotware VSL (Model 900B) | Aurora Scientific | ||
Inverted Microscope (IX51) | Olympus |