Özet

جيل من الأناكسولوت الشيميري مع أطراف هابلويد متحولة من خلال التطعيم الجنيني

Published: January 29, 2020
doi:

Özet

هذا الهدف من هذا البروتوكول هو إنتاج axolotls الوهمي مع الأطراف الأمامية haploid المستمدة من الأنسجة المانحة Cas9 المغيرة باستخدام تقنيات تطعيم الأنسجة الجنينية.

Abstract

وهناك مجموعة متزايدة من التقنيات الوراثية والموارد تمكن الباحثين من استكشاف الأصول الجزيئية لقدرة بعض أنواع السلمندر، مثل الأكسولوت، على تجديد أطرافها بأكملها كبالغين. هنا ، نحدد التقنيات المستخدمة لتوليد الأكسولوتات الشيميرية مع الأطراف الأمامية haploid Cas9 المغيرة التي يمكن استخدامها لاستكشاف وظيفة الجينات ودقة تجديد الأطراف. نحن نجمع بين العديد من التقنيات الجنينية والجينية ، بما في ذلك توليد haploid عن طريق التنشيط في المختبر ، وCRISPR / Cas9 mutagenesis ، وتطعيم الأنسجة في بروتوكول واحد لإنتاج نظام فريد للفحص الوراثي haploid في كائن نموذجي للتجديد. تقلل هذه الاستراتيجية من عدد الحيوانات والمساحة والوقت اللازم للتحليل الوظيفي للجينات في تجديد الأطراف. وهذا يسمح أيضا بالتحقيق في وظائف تجديد محددة من الجينات التي قد تكون مطلوبة لعمليات أساسية أخرى، مثل تكوين الأعضاء، ومورفولوجيا الأنسجة، وغيرها من العمليات الجنينية الأساسية. الطريقة الموصوفة هنا هي منصة فريدة لإجراء الفحص الوراثي haploid في نظام نموذج الفقاريات.

Introduction

تاريخيا، كان تطعيم الأنسجة الجنينية في البرمائيات تقنية هامة لاستكشاف الآليات الأساسية لبيولوجيا النمو والتجدد. يمتلك الأكسولوتل، وهو نوع من السلمندر، قدرة مثيرة للإعجاب على تجديد الأنسجة والهياكل المعقدة مثل الأطراف والأعضاء بعد الإصابة أو البتر. وبالمثل، فإنها يمكن أن تتلقى، دون رفض، ترقيع الأنسجة من أفراد آخرين في مراحل الجنين، والأحداث، والكبار3. مناطق الأجنة التي تنتج هياكل كاملة مثل الأطراف والذيول والعينين والرؤوس ، والأنسجة الأكثر تحديدًا ، مثل neuroectoderm والسوميتس ، يمكن تطعيمها بين الأجنة لإنتاج الحيوانات الشيمية1،2،4،5،6. على مدى ما يقرب من قرن من الزمان ، قدمت دراسات مثل هذه الحيوانات الوهمية رؤى حاسمة في التجديد ، وتمايز الأنسجة ، والتحكم في الحجم ، ونمط1،7،8.

في العقد الماضي ، أنتجت العديد من الدراسات النسخة من الأنسجة التجدد رؤى في البرامج الوراثية الكامنة وراء تجديد السلمندر9،10،11،12،13. وقد أضافت هذه الدراسات إلى قائمة موسعة من الجينات المرشحة التي، حتى الآن، غير قابلة للتوصيف إلى حد كبير في سياق التجديد. تقنيات الطفرات المستهدفة ، مثل CRISPR / Cas ، تسمح الآن بالتحقيق في مثل هذه الجينات ، ويتم تسهيل هذه النهج الجينية إلى حد كبير من خلال التسلسل والتجميع الأخير لجينوم axolotl الكبير14،15،16.

سعينا لتطوير التقنيات التي قرنت البيولوجيا التنموية الكلاسيكية مع التكنولوجيا الوراثية الجديدة لغرض تشريح آليات التجديد. وقد وضعت أساليب لتوليد الأجنة haploid من axolotls وغيرها من السلمندر لعقود17. في حين أن هذه التقنيات قد لوحظ منذ فترة طويلة لتكون مزايا السلمندر ككائنات النموذج الجيني18، إلا أن الدراسات الجينية اللاحقة قليلة أدرجت الحيوانات الهابلويد. نحن نستخدم في تنشيط المختبر في axolotl لإنتاج الأجنة haploid التي تعمل كمتبرعين الأنسجة لتطعيم19. باستخدام الأجنة التي تحمل علامات وراثية فلورية ، ابتكرنا طرقًا موثوقة لتوليد الأطراف المشتقة بالكامل تقريبًا من أنسجة المتبرعين(الشكل 1A). من خلال الجمع بين هاتين التقنيتين ، تجاوزنا الفتك الجنيني المتأخر المرتبط بالهابلويد ، مما يسمح بإنتاج أطراف هابلويد مطورة تمامًا والمطعمة(الشكل 1B، الشكل 1B، والشكل 2).

من خلال إجراء CRISPR / Cas بوساطة الطفرات في الأجنة haploid قبل التطعيم لإنشاء axolotls الوهمي مع أطرافها هابلويد متحولة ، قد نحقق في وظيفة الجينات على وجه التحديد في سياق تطور الأطراف وتجديدها. وهذا يسمح بإنقاذ الأطراف من الأنماط الظاهرية المتحولة الجنينية المحتملة. في حين يمكن أن تولد CRISPR / Cas microinjection الحيوانات التي هي متحولة للغاية ، فإن هذه الحيوانات عادة ما تكون فسيفساء عالية ، مع درجة ما من الاحتفاظ بأليلات النمط البري ومجموعة متنوعة من الطفرات المتميزة في المواقع المستهدفة14،20. CRISPR القائم على الطفرات في خلايا haploid يزيد من penetrance واحد أليل فقدان وظيفة الطفرات، كما أنها لا يمكن أن تكون ملثمين من قبل alleles البرية المحتفظ بها. لهذا السبب ، يتم استخدام الفحص القائم على CRISPR في خطوط الخلايا haploid بشكل متزايد للتحقيق في الأساس الوراثي للعديد من العمليات الخلوية21،22،23. من خلال الجمع بين تتبع النسب CRISPR المستندة إلى بروتوكولات تطعيم برعم الأطراف haploid ، يمكن للنهج الموصوف هنا أن يكون بمثابة منصة للشاشات الوراثية haploid في الحيوانات الحية20.

Protocol

تمت الموافقة على الإجراءات التجريبية المستخدمة في هذا البروتوكول من قبل لجنة رعاية الحيوانات المؤسسية واستخدامها في جامعة ييل (IACUC، 2017-10557) وكانت متفقة مع جميع السياسات والمبادئ التوجيهية الاتحادية التي تحكم استخدام الحيوانات الفقارية. أجريت جميع التجارب على الحيوانات على Ambystoma mexicanum</e…

Representative Results

يمكن تمييز الأجنة الهابلويد النامية من الأجنة الدوبلويد من خلال “متلازمة haploid” النمط الظاهري29. في مرحلة الكسب غير المشروع ، تعرض الأجنة الهابلويد انحناءً انحنٍ على طول المحور الأمامي الخلفي والضميمة غير المكتملة لقابس الصفار(الشكل 3A).</str…

Discussion

هناك عدد قليل من الخطوات الحاسمة في بروتوكولنا لتوليد الكيميرا haploid-diploid أن فني التشغيل يجب أن تنظر في نتائج التطعيم متسقة.

السبب الأكثر احتمالاً لفشل جيل haploid يرجع إلى ظروف التنشيط السيئة في المختبر. يجب استخدام الكميات المناسبة من الحيوانات المنوية المتحركة لتنشيط البيض. ?…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

نود أن نشكر (كاثرين روبرتس) على رعايتها لمستعمرة (أكسولوتل) تم توفير التمويل لهذا العمل من قبل صندوق أبحاث الطب التجديدي للابتكارات في ولاية كونيتيكت (15RMA-YALE-09 و 15-RMB-YALE-01) ومعهد يونيس كينيدي شرايفر الوطني لصحة الطفل والتنمية البشرية (ما بعد الدكتوراه الفردية زمالة F32HD086942).

Materials

#55 Dumont Forceps Fine Science Tools 11295-1 Only use Dumostar material (can be autoclaved)
Amphotericin B Sigma Aldrich A2942-20ML 20 mL
Antibiotic-Antimycotic 100x Thermo Fisher 15240062
Ciprofloxacin Sigma Aldrich 17850-5G-F
Ficoll 400 (polysucrose 400) bioworld 40600032-3 Ficoll 400
Gentamicin Sigma Aldrich G1914-250MG
Heating/Cooling Incubator RevSci RS-IF-233
Human Chorionic Gonadotropin Merk Chorulon
Megascript T7 Transcription Kit Thermo Fisher AM1334 40 reactions
Miroscope Cooling Stage Brook Industries Custom Custom
NLS Cas9 Protein PNAbio CP01-200 4 vials of 50 µg protein each
Plasmocin Invivogen ant-mpt-1 Treatment level
Recipes
1.0x Marc's modified Ringer's solution (MMR) 0.1 M NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 0.1 mM EDTA, 5 mM HEPES (pH 7.8), ph 7.4
40% Holtfreter's solution 20 mM NaCl, 0.2 mM KCl, 0.8 mM NaHCO3, 0.2 mM CaCl2, 4 mM MgSO4, pH to 7.4

Referanslar

  1. Kragl, M., et al. Cells keep a memory of their tissue origin during axolotl limb regeneration. Nature. 460 (7251), 60-65 (2009).
  2. Maden, M., Goodwin, B. C. Experiments on developing limb buds of the axolotl Ambystoma mexicanum. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 57, 177-187 (1980).
  3. McCusker, C. D., Diaz-Castillo, C., Sosnik, J., Phan, A. Q., Gardiner, D. M. Cartilage and bone cells do not participate in skeletal regeneration in Ambystoma mexicanum limbs. Gelişim Biyolojisi. 416 (1), 26-33 (2016).
  4. Brun, R. B. Experimental analysis of the eyeless mutant in the mexican axolotl (Ambystoma mexicanum). Integrative and Comparative Biology. 18 (2), 273-279 (1978).
  5. Lopez, D., et al. Mapping hematopoiesis in a fully regenerative vertebrate: the axolotl. Blood. 124 (8), 1232-1242 (2014).
  6. de Both, N. J. Transplantation of Axolotl Heads. Science. 162 (3852), 460-461 (1968).
  7. Harrison, R. G. Some Unexpected Results of the Heteroplastic Transplantation of Limbs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 10 (2), 69-74 (2006).
  8. Fields, E., French, V., Bryant, P. J., Bryant, S. V Pattern regulation in epimorphic fields. Science. 193 (4257), 969-981 (2013).
  9. Gerber, T., et al. Single-cell analysis uncovers convergence of cell identities during axolotl limb regeneration. Science. 362 (6413), (2018).
  10. Knapp, D., et al. Comparative transcriptional profiling of the axolotl limb identifies a tripartite regeneration-specific gene program. PloS One. 8 (5), e61352 (2013).
  11. Campbell, L. J., et al. Gene expression profile of the regeneration epithelium during axolotl limb regeneration. Developmental Dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 240 (7), 1826-1840 (2011).
  12. Bryant, D. M., et al. A Tissue-Mapped Axolotl De Novo Transcriptome Enables Identification of Limb Regeneration Factors. Cell Reports. 18 (3), 762-776 (2017).
  13. Gardiner, D. M., et al. Gene expression during the first 28 days of axolotl limb regeneration I: Experimental design and global analysis of gene expression. Regeneration. 2 (3), 120-136 (2015).
  14. Flowers, G. P., Timberlake, A. T., McLean, K. C., Monaghan, J. R., Crews, C. M. Highly efficient targeted mutagenesis in axolotl using Cas9 RNA-guided nuclease. Development. 141 (10), 2165-2171 (2014).
  15. Smith, J. J., et al. A Chromosome-Scale Assembly of the Enormous (32 Gb) Axolotl Genome. bioRxiv. , 373548 (2018).
  16. Nowoshilow, S., et al. The axolotl genome and the evolution of key tissue formation regulators. Nature. 559 (7712), 50-55 (2018).
  17. Fankhauser, B. Y. G. The Effects of Changes in Chromosome Number on Amphibian Development. The Quarterly Review of Biology. 20 (1), 20-78 (1945).
  18. Malacinski, G. M., Brothers, A. J. Mutant Genes in the Mexican Axolotl. Science. 184 (4142), 1142-1147 (1974).
  19. Armstrong, B. Gynogenesis in the mexican axolotl. Genetik. 83 (4), 783-792 (1976).
  20. Flowers, G. P., Sanor, L. D., Crews, C. M. Lineage tracing of genome-edited alleles reveals high fidelity axolotl limb regeneration. eLife. 6, 1-15 (2017).
  21. Shalem, O., et al. Genome – scale CRISPR – Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
  22. Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. Genetic Screens in Human Cells Using the CRISPR-Cas9 System. Science. 343 (6166), 80-84 (2014).
  23. Yin, Z., Chen, L. Simple Meets Single: The Application of. CRISPR/Cas9 in Haploid Embryonic Stem Cells. Stem Cells International. 2017, 1-6 (2017).
  24. Khattak, S., et al. Optimized axolotl (Ambystoma mexicanum) husbandry, breeding, metamorphosis, transgenesis and tamoxifen-mediated recombination. Nature Protocols. 9 (3), 529-540 (2014).
  25. Vachon, P., Zullian, C., Dodelet-Devillers, A., Roy, S. Evaluation of the anesthetic effects of MS222 in the adult Mexican axolotl (Ambystoma mexicanum). Veterinary Medicine: Research and Reports. 7, 1-7 (2016).
  26. Montague, T. G., et al. Efficient Mutagenesis by Cas9 Protein-Mediated Oligonucleotide Insertion and Large-Scale Assessment of Single-Guide RNAs. PLoS One. 9 (5), (2014).
  27. Moreno-Mateos, M. A., et al. CRISPRscan: designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo. Nature Methods. 12 (10), 982-988 (2015).
  28. Kumar, A., Simon, A. . Salamanders in Regeneration Research: Methods and Protocols. , (2015).
  29. Hronowski, L., Gillespie, L. L., Armstrong, J. B. Development and Survival of Haploids of the Mexican Axolotl, Ambystoma mexicanum. Journal of Experimental Zoology. 209, 41-47 (1979).
  30. Schreckenberg, G. M., Jacobson, A. G. Normal stages of development of the axolotl, Ambystoma mexicanum. Gelişim Biyolojisi. 42 (2), 391-399 (1975).
  31. Hertwig, G. Beitrage Zum Determinations- Und Regenerationsproblem Mittels Der Transplantation Haploidkerniger Zellen. Archiv f. Entwicklungsmechanik. 111, 292-316 (1927).
  32. Fei, J. -. F., et al. Efficient gene knockin in axolotl and its use to test the role of satellite cells in limb regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (47), 12501-12506 (2017).

Play Video

Bu Makaleden Alıntı Yapın
Sanor, L. D., Flowers, G. P., Crews, C. M. Generation of Chimeric Axolotls with Mutant Haploid Limbs Through Embryonic Grafting. J. Vis. Exp. (155), e60156, doi:10.3791/60156 (2020).

View Video