배아 이식을 통해 돌연변이 Haploid 사지를 가진 키메라 색소꽃의 생성
Özet
이 프로토콜의 목적은 배아 조직 이식 기술을 사용하여 Cas9 돌연변이 공여자 조직에서 유래한 haploid 앞다리를 가진 키메라 액록톨을 생산하는 것입니다.
Abstract
유전 기술과 자원의 성장 세트는 연구원이 성인으로 전체 사지를 재생하는 축색꽃과 같은 도롱뇽의 일부 종의 능력의 분자 기원을 탐구 할 수 있습니다. 여기에서, 우리는 유전자 기능 및 사지 재생의 충실도를 탐구하기 위하여 이용될 수 있는 Cas9 돌연변이 화한 haploid 앞다리를 가진 키메라 axolotls를 생성하는 데 이용된 기술을 개략적으로 설명합니다. 우리는 시험관 내 활성화, CRISPR/Cas9 돌연변이 발생, 조직 이식을 통해 여러 배아 및 유전 적 기술을 결합하여 재생의 모델 유기체에서 haploid 유전 스크리닝을위한 독특한 시스템을 생산합니다. 이 전략은 사지 재생에서 유전자의 기능 적 분석에 필요한 동물, 공간 및 시간의 수를 감소시킨다. 이것은 또한 유기 발생 조직 형성, 조직 형태 형성 및 그밖 필수 배아 프로세스와 같은 그밖 필수 프로세스를 위해 요구될 수 있는 유전자의 재생 특정 기능의 조사를 허용합니다. 여기에 설명된 방법은 척추동물 모델 시스템에서 haploid 유전자 스크리닝을 수행하기위한 독특한 플랫폼입니다.
Introduction
역사적으로, 양서류에 있는 배아 조직 이식은 발달 생물학 및 재생의 근본적인 기계장치를 탐구하기 위한 중요한 기술이었습니다. 도롱뇽 의 종 인 액소로틀은 부상이나 절단 후 사지 및 장기와 같은 조직과 복잡한 구조를 재생하는 인상적인 능력을 가지고 있습니다. 마찬가지로 인상적으로, 그들은 배아, 청소년 및 성인 단계1,2,3에서다른 개인으로부터 거부, 조직 이식을받지 않고받을 수 있습니다. 사지, 꼬리, 눈 및 머리와 같은 전체 구조를 생성하는 배아의 영역, 신경 외피 및 소미트와 같은 보다 구체적인 조직은 키메라 동물을 생산하기 위해 배아 사이에 이식 될 수 있습니다1,2,4,5,6. 거의 한 세기 동안, 이러한 키메라 동물의 연구는 재생에 중요한 통찰력을 제공하고있다, 조직 분화, 크기 제어, 및 패터닝1,7,8.
지난 10 년 동안, 재생 조직의 수많은 전사 연구는 도롱뇽 재생9,10,11,12,13의기본 유전 프로그램에 대한 통찰력을 생산하고있다. 이 연구 결과는, 현재까지, 재생의 맥락에서 크게 특성화되지 않은 후보 유전자의 확장 목록에 추가했습니다. CRISPR/Cas와 같은 표적 돌연변이 유발 기술은 이제 이러한 유전자의 조사를 허용하고, 이러한 유전적 접근법은 최근 큰 액소로틀 게놈14,15,16의시퀀싱 및 조립에 의해 크게 촉진된다.
우리는 재생의 기계장치를 해부하기 위한 목적으로 고전적인 발달 생물학을 새로운 유전 기술과 결합하는 기술을 개발하고자 했습니다. 액소로톨 및 기타 도롱뇽의 하플로이드 배아를 생성하는 방법은 수십 년 동안17년동안 확립되어 왔다. 이러한 기술은 오랫동안 유전 모델유기체18로도롱뇽의 장점으로 지적되었지만, 몇 가지 후속 유전 연구는 haploid 동물을 통합했다. 우리는이식19를위한 조직 기증자역할을 하는 haploid 배아를 생성하기 위하여 axolotl에 있는 시험관 내 활성화를 이용합니다. 형광 유전 마커를 운반하는 배아를 사용하여, 우리는 기증자 조직에서 거의 전적으로 파생된 사지를 생성하기 위한 믿을 수 있는 방법을 고안했습니다(그림 1A). 이 두 기술을 결합해서, 우리는 haploidy와 관련되었던 늦은 배아 치사성을 우회하여, 완전히 개발된, 이식된 haploid 사지의 생산을 허용합니다(그림 1B, 그림 1B’및 그림 2).
돌연변이 haploid 사지를 가진 키메라 axolotls를 만들기 위하여 이식하기 전에 haploid 태아에 있는 CRISPR/Cas 중재한 돌연변이 발생을 수행해서, 우리는 사지 발달 과 재생의 문맥 내의 유전자 기능을 구체적으로 조사할 수 있습니다. 이것은 잠재적으로 배아 치명적인 돌연변이 표현형에서 사지의 구출을 허용합니다. CRISPR/Cas 미세주사는 매우 돌연변이가 높은 동물을 생성할 수 있지만, 이러한 동물은 전형적으로 매우 모자이크이며, 어느 정도의 야생형 대두류및 표적 부위에서의 다양한 뚜렷한돌연변이를가진다.4,20. haploid 세포에 있는 CRISPR 기지를 둔 돌연변이 발생은 유지된 야생형 eeles에 의해 마스크될 수 없기 때문에, 기능의 단 하나 대문자 손실 돌연변이의 침투를 증가합니다. 이러한 이유로, 하플로이드 세포주에서 CRISPR 기반 스크리닝은 많은 세포 과정의 유전적 기초를 조사하기 위해 점점 더 많이 사용되고있다 21,22,23. CRISPR 기반 계보 추적과 우리의 haploid 사지 싹 접목 프로토콜을 결합함으로써, 여기에 설명된 접근법은 살아있는 동물20에서haploid 유전 스크린을 위한 플랫폼으로 작용할 수 있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
운영 기술자가 일관된 접목 결과를 위해 고려해야 할 haploid-diploid 키메라를 생성하기 위한 프로토콜에는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다.
haploid 생성이 실패하는 가장 가능성이 높은 이유는 시험관 내 활성화 조건이 좋지 기 때문입니다. 운동성 정자의 적당한 양은 계란을 활성화하기 위하여 이용되어야 합니다. 운동성을 연장하기 위해 정자 샘플은 항상 4 °C에서 유지되어야…
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 축색동 식민지의 그녀의 배려에 대한 캐서린 로버츠에게 감사드립니다. 이 작업에 대한 기금은 코네티컷 혁신 재생 의학 연구 기금 (15RMA-YALE-09 및 15-RMB-YALE-01)과 유니스 케네디 슈리버 국립 아동 건강 및 인간 개발 연구소 (개별 박사 후 박사 과정)에 의해 제공되었습니다. 펠로우십 F32HD086942).
Materials
| #55 Dumont Forceps | Fine Science Tools | 11295-1 | Only use Dumostar material (can be autoclaved) |
| Amphotericin B | Sigma Aldrich | A2942-20ML | 20 mL |
| Antibiotic-Antimycotic 100x | Thermo Fisher | 15240062 | |
| Ciprofloxacin | Sigma Aldrich | 17850-5G-F | |
| Ficoll 400 (polysucrose 400) | bioworld | 40600032-3 | Ficoll 400 |
| Gentamicin | Sigma Aldrich | G1914-250MG | |
| Heating/Cooling Incubator | RevSci | RS-IF-233 | |
| Human Chorionic Gonadotropin | Merk | Chorulon | |
| Megascript T7 Transcription Kit | Thermo Fisher | AM1334 | 40 reactions |
| Miroscope Cooling Stage | Brook Industries | Custom | Custom |
| NLS Cas9 Protein | PNAbio | CP01-200 | 4 vials of 50 µg protein each |
| Plasmocin | Invivogen | ant-mpt-1 | Treatment level |
| Recipes | |||
| 1.0x Marc's modified Ringer's solution (MMR) | 0.1 M NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 0.1 mM EDTA, 5 mM HEPES (pH 7.8), ph 7.4 | ||
| 40% Holtfreter's solution | 20 mM NaCl, 0.2 mM KCl, 0.8 mM NaHCO3, 0.2 mM CaCl2, 4 mM MgSO4, pH to 7.4 |
Referanslar
- Kragl, M., et al. Cells keep a memory of their tissue origin during axolotl limb regeneration. Nature. 460 (7251), 60-65 (2009).
- Maden, M., Goodwin, B. C. Experiments on developing limb buds of the axolotl Ambystoma mexicanum. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 57, 177-187 (1980).
- McCusker, C. D., Diaz-Castillo, C., Sosnik, J., Phan, A. Q., Gardiner, D. M. Cartilage and bone cells do not participate in skeletal regeneration in Ambystoma mexicanum limbs. Gelişim Biyolojisi. 416 (1), 26-33 (2016).
- Brun, R. B. Experimental analysis of the eyeless mutant in the mexican axolotl (Ambystoma mexicanum). Integrative and Comparative Biology. 18 (2), 273-279 (1978).
- Lopez, D., et al. Mapping hematopoiesis in a fully regenerative vertebrate: the axolotl. Blood. 124 (8), 1232-1242 (2014).
- de Both, N. J. Transplantation of Axolotl Heads. Science. 162 (3852), 460-461 (1968).
- Harrison, R. G. Some Unexpected Results of the Heteroplastic Transplantation of Limbs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 10 (2), 69-74 (2006).
- Fields, E., French, V., Bryant, P. J., Bryant, S. V Pattern regulation in epimorphic fields. Science. 193 (4257), 969-981 (2013).
- Gerber, T., et al. Single-cell analysis uncovers convergence of cell identities during axolotl limb regeneration. Science. 362 (6413), (2018).
- Knapp, D., et al. Comparative transcriptional profiling of the axolotl limb identifies a tripartite regeneration-specific gene program. PloS One. 8 (5), e61352 (2013).
- Campbell, L. J., et al. Gene expression profile of the regeneration epithelium during axolotl limb regeneration. Developmental Dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 240 (7), 1826-1840 (2011).
- Bryant, D. M., et al. A Tissue-Mapped Axolotl De Novo Transcriptome Enables Identification of Limb Regeneration Factors. Cell Reports. 18 (3), 762-776 (2017).
- Gardiner, D. M., et al. Gene expression during the first 28 days of axolotl limb regeneration I: Experimental design and global analysis of gene expression. Regeneration. 2 (3), 120-136 (2015).
- Flowers, G. P., Timberlake, A. T., McLean, K. C., Monaghan, J. R., Crews, C. M. Highly efficient targeted mutagenesis in axolotl using Cas9 RNA-guided nuclease. Development. 141 (10), 2165-2171 (2014).
- Smith, J. J., et al. A Chromosome-Scale Assembly of the Enormous (32 Gb) Axolotl Genome. bioRxiv. , 373548 (2018).
- Nowoshilow, S., et al. The axolotl genome and the evolution of key tissue formation regulators. Nature. 559 (7712), 50-55 (2018).
- Fankhauser, B. Y. G. The Effects of Changes in Chromosome Number on Amphibian Development. The Quarterly Review of Biology. 20 (1), 20-78 (1945).
- Malacinski, G. M., Brothers, A. J. Mutant Genes in the Mexican Axolotl. Science. 184 (4142), 1142-1147 (1974).
- Armstrong, B. Gynogenesis in the mexican axolotl. Genetik. 83 (4), 783-792 (1976).
- Flowers, G. P., Sanor, L. D., Crews, C. M. Lineage tracing of genome-edited alleles reveals high fidelity axolotl limb regeneration. eLife. 6, 1-15 (2017).
- Shalem, O., et al. Genome – scale CRISPR – Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
- Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. Genetic Screens in Human Cells Using the CRISPR-Cas9 System. Science. 343 (6166), 80-84 (2014).
- Yin, Z., Chen, L. Simple Meets Single: The Application of. CRISPR/Cas9 in Haploid Embryonic Stem Cells. Stem Cells International. 2017, 1-6 (2017).
- Khattak, S., et al. Optimized axolotl (Ambystoma mexicanum) husbandry, breeding, metamorphosis, transgenesis and tamoxifen-mediated recombination. Nature Protocols. 9 (3), 529-540 (2014).
- Vachon, P., Zullian, C., Dodelet-Devillers, A., Roy, S. Evaluation of the anesthetic effects of MS222 in the adult Mexican axolotl (Ambystoma mexicanum). Veterinary Medicine: Research and Reports. 7, 1-7 (2016).
- Montague, T. G., et al. Efficient Mutagenesis by Cas9 Protein-Mediated Oligonucleotide Insertion and Large-Scale Assessment of Single-Guide RNAs. PLoS One. 9 (5), (2014).
- Moreno-Mateos, M. A., et al. CRISPRscan: designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo. Nature Methods. 12 (10), 982-988 (2015).
- Kumar, A., Simon, A. . Salamanders in Regeneration Research: Methods and Protocols. , (2015).
- Hronowski, L., Gillespie, L. L., Armstrong, J. B. Development and Survival of Haploids of the Mexican Axolotl, Ambystoma mexicanum. Journal of Experimental Zoology. 209, 41-47 (1979).
- Schreckenberg, G. M., Jacobson, A. G. Normal stages of development of the axolotl, Ambystoma mexicanum. Gelişim Biyolojisi. 42 (2), 391-399 (1975).
- Hertwig, G. Beitrage Zum Determinations- Und Regenerationsproblem Mittels Der Transplantation Haploidkerniger Zellen. Archiv f. Entwicklungsmechanik. 111, 292-316 (1927).
- Fei, J. -. F., et al. Efficient gene knockin in axolotl and its use to test the role of satellite cells in limb regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (47), 12501-12506 (2017).
