Bu protokolün amacı, kayma stresi ile mekanik duyarlı iyon kanallarının gerçek zamanlı aktivasyonunu araştırırken kullanılmak üzere değiştirilmiş bir paralel plaka akış odasını tarif etmektir.
Sıvı kesme stres iyi endotel fonksiyonunda önemli bir rol oynamak için bilinmektedir. Çoğu vasküler yataklarda, kan akışındaki akut artışlardan kaynaklanan yüksek kesme gerilimi, damar duvarındaki mekanik stresin azaltılması için vazodilasyona neden olan sinyalizasyon basamaklarını tetikler. Kesme stres deseni de iyi bir ateroskleroz gelişiminde önemli bir faktör olarak bilinen laminar kesme stres atherokoruyucu ve rahatsız kesme stres Pro-atojik olmak. Biz çeşitli ara hücre sinyalizasyon yolları ayrıntılı bir anlayış var iken, ilk kimyasal mediatörlere mekanik uyarıcı tercüme reseptörleri tamamen anlaşılır değildir. Mekanik duyarlı iyon kanalları, böylece vazoaktif mediatörlerin üretimini kontrol etmek için kesme ve kesme kaynaklı hücre sinyalleme düzenleyen yanıt için önemlidir. Bu kanallar, kesme için en erken aktif sinyal bileşenleri arasındadır ve nitrik oksit üretimini teşvik ederek kesme kaynaklı vazodilasyona bağlanmıştır (örn., K+ [kır] ve geçici reseptör potansiyeli [TRP] kanallar) ve endotelyum hiperpolarizasyon faktörü (örn., kir ve kalsiyum aktive K+ [KCA] kanallar) ve piezo kanalları içeren belirlenmemiş bir mekanizma aracılığıyla kesme kaynaklı vazokonstriksiyon. Bu kanalların kesme kuvvetleri tarafından aktive edildiği Biyofizik mekanizmayı anlamak (örneğin, doğrudan veya birincil mekanik reseptör yoluyla), endotel disfonksiyon ile ilişkili patofisyolojisi çözmek için potansiyel yeni hedefler sağlayabilir ve Atherogenesis. Elektrofizyoloji kullanarak gerçek zamanlı iyon kanallarının akış kaynaklı aktivasyonunu kaydetmek için hala önemli bir sorundur. Hücreleri iyi tanımlanmış kesme stresine maruz bırakmak için standart yöntemler, örneğin koni ve plaka reometresi ve kapalı paralel plaka akış odası iyon kanalı aktivasyonunun gerçek zamanlı çalışmasına izin vermez. Bu protokolün amacı, iyi tanımlanmış kayma stres altında mekanik duyarlı iyon kanallarının gerçek zamanlı elektrofizyolojik kayıt sağlayan değiştirilmiş bir paralel plaka akış odası açıklamak için.
Kan akışının oluşturduğu hemodinamik kuvvetler, endotel ve vasküler fonksiyonların1,2‘ de önemli roller çalmaktadır. Aynı zamanda iyon kanallarının çeşitli türleri akut kayma stres değişiklikleri yanıt bilinmektedir3,4,5 hipotezi için iyon kanalları primer kesme stres sensörleri olabilir lider. Daha yakın zamanda, biz ve diğerleri mekanik duyarlı iyon kanalları çeşitli kesme stres duyarlı damar fonksiyonları kritik roller oynamak gösterdi, kırma stres vazoaktif yanıt dahil olmak üzere6,7,8 ve gelişimsel anjiyogenez9. Ancak, iyon kanallarının kesme-stres hassasiyeti mekanizmaları neredeyse tamamen bilinmiyor. Bu bilgi boşluğu, iyi tanımlanmış kayma stres altında elektrofizyolojik kayıtların gerçekleştirilmesi teknik zorluk nedeniyle muhtemeldir. Bu makalede, bu nedenle, bu hedefe ulaşmak için laboratuvarımızda rutin olarak gerçekleştirilen bir adım adım ayrıntılı protokol sunuyoruz6,7,10,11.
Bu yöntemin genel amacı, fizyolojik aralıkta iyi tanımlanmış kesme stres altında iyon kanal mechanoactivation gerçek zamanlı soruşturma sağlamak için. Bu, standart bir paralel plaka akış odası değiştirerek elde edilir bir elektrofizyolojik pipet odasına indirilerek ve erişim hücreleri alt plaka üzerinde gerçek zamanlı akımına maruz kalma sırasında yetiştirilen, bu elde etmek için benzersiz bir yaklaşım sağlar hedef6,7,11. Buna karşılık, önceki yayınlarda açıklanan standart paralel plaka akış odaları, kesme kuvvetlerine maruz kalan hücrelerin gerçek zamanlı görüntüleme analizi için kullanılabilir12 veya diğer non-invaziv yaklaşımlar13,14 ama değil Elektrofizyoloji. Benzer şekilde, koni ve plaka aparatı, hücreleri açığa çıkarmak için başka bir güçlü yaklaşım15,16 kesme stres de elektrofizyolojik kayıtlar için uygun değildir. Böylece, bu akış cihazları iyon kanallarının kesme stres hassasiyeti araştırılması izin vermez. Akış altında elektrofizyolojik kayıtların gerçekleştirilmesinde zorluk, bu önemli etkilerden sorumlu mekanizmalar hakkında bilgi sağlamlığı için ana nedenidir.
Aynı hedefe ulaşmak için alternatif yaklaşımlar açısından, doğru veya kontrollü olan hiçbiri vardır. Bazı önceki çalışmalar,17,18yukarıdakinden bir hücrenin yakınında getirilen başka bir pipet gelen sıvı akışına hücreleri göstererek akış altında iyon kanal etkinliğini kaydetmeye çalıştı. Bu son derece fizyolojik olmayan, bu koşullarda oluşturulan mekanik kuvvetler kan damarlarında kesme stres fizyolojik profilleri ile ortak az olduğu gibi. Benzer endişeler açık odaların perfüzyon fizyolojik kesme stres simüle girişimleri için geçerlidir. Daha önceki çalışma10‘ da ayrıntılı olarak anlatıldığı gibi, açık bir sıvı hava arayüzü, fizyolojik olmayan, birden fazla bozulma ve devridaim oluşturur. Tüm bu endişeleri gidermek için, daha önceki çalışmalarımız6,7,10,11, yapılan “minimal invazif akış cihazı” olarak da adlandırılan değiştirilmiş bir paralel plaka (MPP) akış odası tasarladık Akrilik ve yaygın laboratuvarımızda kullanılır. Ancak, tasarımın orijinal tanımı neredeyse 20 yıl önce yayınlandı olmasına rağmen ve iyi tanımlanmış kesme stres altında elektrofizyolojik kayıtların gerçekleştirilmesi sağlayan tek akış cihazdır, Bu metodoloji değil diğer laboratuvarlar tarafından benimsenmiştir ve akış altında akımları kaydetmek için girişim sadece çok az sayıda çalışmalar vardır. Bu nedenle, MPP akış odasını kullanmak için ayrıntılı bir açıklama sağlayan, mekanik duyarlı iyon kanalları ve vasküler biyoloji ile ilgilenen araştırmalar için büyük yardımcı olacaktır inanıyoruz.
Vasküler sistem sürekli aktif hemodinamik kuvvetlere maruz kalmaktadır, hangi mekanik duyarlı iyon kanalları etkinleştirmek,3,22 ama bu kanallar kesme stres kaynaklı mechanotransdution içinde fizyolojik rolleri sadece 4,6,8ortaya çıkmaya başlıyor. Kesme stres aktif kanalların mekanik sensitivitesi sorumlu mekanizmalar bilinmeyen kalır. Burada ayrıntılı p…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma Ulusal Kalp, akciğer ve kan Enstitüsü (R01 HL073965, IL) ve (T32 HL007829-24, ıSF) tarafından finanse edilmiştir. Yazarlar da en son MPP akış odaları oluşturmak için Chicago Illinois Üniversitesi ‘nde bilimsel makine dükkanı kabul etmek istiyorum.
0.2 µm sterile syringe filters | VWR | 28145-501 | Used for filtering electrophysiolgoical pipette solution |
5 grade forceps | Fine Scientific Tools | 1252-30 | Used for transferring digested arteries to fresh solution |
9" Pasteur Pipet | Fisher Scientifc | 13-678-20D | Used for mechanically disrupting digested arteries and transferring freshly isolated endohtelial cells |
12 mm diameter Cover glass circles | Fisher Scientifc | 12-545-80 | For use with studies involving cultured cells and multiple treatments. Cells adhered to the cover glass are used for patch clamp analyses |
24 x 40 mm Rectangluar Cover glass | Sigma-Aldrich | CLS2975224 | Cover glass to be added to MPP flow chamber pieces C (Figure 1) |
24 x 50 mm Rectangluar Cover glass | Sigma-Aldrich | CLS2975245 | Cover glass to be added to MPP flow chamber E (Figure 1) |
20 gauge syringe needles | Becton Dickinson and Co | 305175 | For use in mechanical disruption of digested mesenteric arteries |
35 mm Petri dish | Genesee Scientific | 32-103 | For use in mechanical disruption of digested mesenteric arteries |
Amphotericin B solubilized | Sigma-Aldrich | A9528-50MG | Used for generating the perforated whole-cell patch configuration. |
collagenase, type I | Worthington Biochemical | 100 mg – LS004194 | Enzyme used in our laboratory as a brief digestion following the initial cocktail of neutral protease and elastase |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientifc | 67-68-5 | Solvent for Amphotericin B used in perforated whole-cell patch clamp |
elastase, lyophilized | Worthington Biochemical | 25 mg – LS002290 | Enzyme used in our laboratory in a cocktail with neutral protease/dispase to begin digestion of arteries for endothelial cell isolation. |
Falcon Tissue culture Plate, 6-well, Flat Bottom with Low Evaporation Lid | Corning | 353046 | For use with studies involving cultured cells and multiple treatments |
neutral protease/dispase | Worthington Biochemical | 10 mg- LS02100 50 mg – LS02104 | Enzyme used in our laboratory in a cocktail with elastase to begin digestion of arteries for endothelial cell isolation |
SylGard | World Precision Instruments | SYLG184 | Silicone elastomer for adhering the rectangular cover slip to the MPP flow chamber pieces C and E (Figure 1) |
Tygon ND 10-80 tubing | Microbore Tubing | AAQ04133 | ID: 0.05 in, OD: 0.09 in, inlet perfusion tubing for adminsitering flow to the chamber |