המטרה של פרוטוקול זה היא לתאר את חדר הזרימה המקביל של לוח הצלחת לשימוש בחקירת הפעלה בזמן אמת של ערוצי יונים מכניטיים הרגישים על ידי הטיית מתח.
מתח הטיית נוזלים ידוע לשחק תפקיד מרכזי בפונקציה אנדותל. ברוב מיטות כלי הדם, מתח הטיה מוגבר מגדילה חריפה בזרימת הדם מעורר אשד איתות וכתוצאה מכך ובכך מקלה על לחץ מכני על הקיר כלי הדם. הדפוס של מתח הטיה ידוע גם להיות גורם קריטי בפיתוח טרשת עורקים עם מלבינו להטות את הלחץ להיות atherop, מופרע להטות מתח להיות pro-atherגנטית. בעוד יש לנו הבנה מפורטת של מסלולים שונים של תא ביניים איתות, הקולטנים הראשונים לתרגם את הגירוי המכני לתוך מגשרים כימיים לא מובנים לחלוטין. ערוצי יונים מכניתרגישים באופן קריטי לתגובה להטיה ולוויסות איתות התא המושרה להטיה ובכך שליטה בייצור מגשרים של vasoactive. ערוצים אלה הם בין הרכיבים המוקדמים ביותר המופעל איתות כדי להטות וקושרו המושרה להטות הנגרמת באמצעות קידום הייצור תחמוצת החנקן (g., מבפנים לתקן K+ [קיר] פוטנציאל קולטן ארעי [trp] ערוצים) ו מקדם היפרפרזת היתר (למשל, קיר והפעלת סידן K+ [kca] ערוצים) ו להטות המושרה באמצעות מנגנון לא נקבע המערבת ערוצי piezo. הבנת המנגנון הביופיזיקלי שדרכו ערוצים אלה מופעלים על-ידי כוחות הטיה (כלומר, ישירות או באמצעות קולטן מכונאי ראשי) יכול לספק מטרות חדשות פוטנציאליות כדי לפתור את הפתופסולוגיה הקשורים בתפקוד האנדותל ו atherogenesis. זה עדיין האתגר העיקרי להקליט הפעלת זרימה המושרה של ערוצי יון בזמן אמת באמצעות אלקטרופיזיולוגיה. השיטות הסטנדרטיות לחשוף תאים למתח הטיה מוגדר היטב, כגון חרוט ולוחית הצלחת ומתח מקביל לוחית הלוח לא מאפשרים מחקר בזמן אמת של הפעלת ערוץ יונים. המטרה של פרוטוקול זה היא לתאר תא זרימה שונה של הלוח המקביל המאפשר הקלטה בזמן אמת אלקטרופיסיולוגית של ערוצי יון מכונאי מוגדר תחת לחץ הטיה מוגדרים היטב.
כוחות הומודינמיים המופקים על ידי זרימת הדם ידועים לשחק תפקידים מרכזיים בפונקציה אנדותל ובתפקוד כלי דם1,2. כמו כן ידוע גם כי מספר סוגים של ערוצי יונים בחריפות להגיב לשינויים בלחץ הטיה3,4,5 המוביל ההשערה כי ערוצי יון יכול להיות ראשי מתח להטות חיישנים. לאחרונה, אנו ואחרים הראו כי ערוצי היונים הרגישים מאוד לשחק תפקידים קריטיים בכמה פונקציות המתח להטות-לחץ רגיש, כולל התגובה vasoactive כדי להטות את הלחץ6,7,8 ואנגיוגנזה התפתחותי9. לעומת זאת, המנגנונים של רגישות ההטיה של ערוצי היונים אינם ידועים כמעט לחלוטין. פער הידע הזה עשוי להיות בשל הקושי הטכני של ביצוע הקלטות אלקטרופיזיולוגיות תחת לחץ גזירה מוגדר היטב. במאמר זה, לכן, אנו מספקים צעד אחר צעד פרוטוקול מפורט באופן שגרתי במעבדה שלנו כדי להשיג את המטרה הזאת6,7,10,11.
המטרה הכוללת של שיטה זו היא לאפשר חקירה בזמן אמת של ערוץ יון מכונאי תחת מוגדר להדגיש הטיה בטווח הפיזיולוגי. זה מושגת על ידי שינוי תא מקביל לוחית הלוח המקביל כדי לאפשר לצינורות אלקטרופיזיולוגיה להיות מופחת לתוך התאים לתאי הגישה גדל על הלוח התחתון בזמן חשיפה ממשית לזרום, מתן גישה ייחודית כדי להשיג את זה . מטרה6,7,11 לעומת זאת, תאים סטנדרטיים מקבילים לוחות הלוח, המתואר בפרסומים קודמים ניתן להשתמש עבור ניתוח הדמיה בזמן אמת של תאים חשופים כוחות הטיה12 או אחרים שאינם פולשנית גישות13,14 אבל לא עבור אלקטרופיזיולוגיה. באופן דומה, חרוט ומכשיר צלחת, עוד גישה רבת עוצמה כדי לחשוף את התאים כדי להטות את הלחץ15,16 הוא גם לא מתאים הקלטות אלקטרופיזיולוגיות. לפיכך, מתקני זרימה אלה אינם מאפשרים את החקירה של הטיית הרגישות של ערוצי יונים. הקושי בביצוע הקלטות אלקטרופיזיולוגיות מתחת לזרימה הוא הסיבה העיקרית לפאולעיר המידע על המנגנונים האחראים להשפעות הקריטיות הללו.
מבחינת הגישות החלופיות להשגת אותה מטרה, אין כאלה מדויקים או מבוקרים. כמה מחקרים קודמים ניסו להקליט את הפעילות ערוץ יון תחת הזרימה על ידי חשיפת תאים לזרם של נוזל המגיע מצינורות אחרים הביא לקרבת תא מ17,18. זה מאוד לא פיזיולוגי, כמו כוחות מכניים שנוצרו בתנאים אלה יש מעט משותף עם פרופילים פיזיולוגיים של מתח הטיה בכלי הדם. חששות דומים חלים על ניסיונות לדמות לחץ הטיה פיסיולוגיים על ידי הפרזיה של התאים הפתוחים. כפי שנדונו בפירוט במחקר המוקדם שלנו10, ממשק פתוח באוויר הנוזלי יוצר הפרעות מרובות, שאינן פיזיולוגיות. כדי לטפל בכל החששות האלה, עיצבנו לוחית מקבילית שונה (MPP) תא זרימה, המכונה גם “מכשיר הזרמת מינימלית פולשנית” במחקרים המוקדמים שלנו6,7,10,11, עשה מאקריליק ושימוש נרחב במעבדה שלנו. עם זאת, למרות העובדה כי התיאור המקורי של העיצוב פורסם כמעט לפני 20 שנה והוא מכשיר הזרימה היחיד המאפשר ביצוע הקלטות אלקטרופיזיולוגיות תחת מוגדרים היטב להדגיש הטיה, מתודולוגיה זו לא היתה שאומצה על-ידי מעבדות אחרות ויש רק מעט מחקרים שמנסים להקליט זרמים בזרם. אנו מאמינים, אפוא, כי מתן תיאור מפורט עבור שימוש בחדר הזרימה MPP יהיה לעזר רב למחקרים המעוניינים בערוצי יון ומכנירגישים וביולוגיה כלי דם.
מערכת כלי הדם נחשפת כל הזמן לכוחות המטדינאמיים הפעילים, המפעילים את ערוצי היון המכניים3,22 אך התפקידים הפיזיולוגיים של הערוצים הללו בהטיה הנגרמת רק . מתחילים להופיע4,6,8 המנגנונים האחראים לרגישות המנגנון של ?…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו ממומנת על ידי הלב הלאומי, ריאות, ובדם המכון (R01 HL073965, IL) ו (T32 HL007829-24, קרן הלאומית). המחברים גם רוצה להכיר את המכונה המדעית חנות באוניברסיטת אילינוי בשיקגו להפקת שלנו האחרונים שלנו לתאי זרימה.
0.2 µm sterile syringe filters | VWR | 28145-501 | Used for filtering electrophysiolgoical pipette solution |
5 grade forceps | Fine Scientific Tools | 1252-30 | Used for transferring digested arteries to fresh solution |
9" Pasteur Pipet | Fisher Scientifc | 13-678-20D | Used for mechanically disrupting digested arteries and transferring freshly isolated endohtelial cells |
12 mm diameter Cover glass circles | Fisher Scientifc | 12-545-80 | For use with studies involving cultured cells and multiple treatments. Cells adhered to the cover glass are used for patch clamp analyses |
24 x 40 mm Rectangluar Cover glass | Sigma-Aldrich | CLS2975224 | Cover glass to be added to MPP flow chamber pieces C (Figure 1) |
24 x 50 mm Rectangluar Cover glass | Sigma-Aldrich | CLS2975245 | Cover glass to be added to MPP flow chamber E (Figure 1) |
20 gauge syringe needles | Becton Dickinson and Co | 305175 | For use in mechanical disruption of digested mesenteric arteries |
35 mm Petri dish | Genesee Scientific | 32-103 | For use in mechanical disruption of digested mesenteric arteries |
Amphotericin B solubilized | Sigma-Aldrich | A9528-50MG | Used for generating the perforated whole-cell patch configuration. |
collagenase, type I | Worthington Biochemical | 100 mg – LS004194 | Enzyme used in our laboratory as a brief digestion following the initial cocktail of neutral protease and elastase |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientifc | 67-68-5 | Solvent for Amphotericin B used in perforated whole-cell patch clamp |
elastase, lyophilized | Worthington Biochemical | 25 mg – LS002290 | Enzyme used in our laboratory in a cocktail with neutral protease/dispase to begin digestion of arteries for endothelial cell isolation. |
Falcon Tissue culture Plate, 6-well, Flat Bottom with Low Evaporation Lid | Corning | 353046 | For use with studies involving cultured cells and multiple treatments |
neutral protease/dispase | Worthington Biochemical | 10 mg- LS02100 50 mg – LS02104 | Enzyme used in our laboratory in a cocktail with elastase to begin digestion of arteries for endothelial cell isolation |
SylGard | World Precision Instruments | SYLG184 | Silicone elastomer for adhering the rectangular cover slip to the MPP flow chamber pieces C and E (Figure 1) |
Tygon ND 10-80 tubing | Microbore Tubing | AAQ04133 | ID: 0.05 in, OD: 0.09 in, inlet perfusion tubing for adminsitering flow to the chamber |