L’obiettivo di questo protocollo è descrivere una camera di flusso a piastre parallela modificata da utilizzare per studiare l’attivazione in tempo reale dei canali ionici meccanosensibili da sollecitazioni di taglio.
Lo stress da taglio fluido è ben noto per svolgere un ruolo importante nella funzione endoteliale. Nella maggior parte dei letti vascolari, lo stress da taglio elevato da aumenti acuti del flusso sanguigno innesca una cascata di segnalazione con conseguente vasodilazione alleviando così lo stress meccanico sulla parete vascolare. Il modello di stress da taglio è anche ben noto per essere un fattore critico nello sviluppo di aterosclerosi con stress di taglio lamiarese essendo ateroprotettivo e disturbato stress di taglio essere aterogenico. Mentre abbiamo una comprensione dettagliata dei vari percorsi di segnalazione delle cellule intermedie, i recettori che prima traducono lo stimolo meccanico in mediatori chimici non sono completamente compresi. I canali ionici meccanosensibili sono fondamentali per la risposta alla cesoia e regolano la segnalazione delle cellule indotta da taglio controllando così la produzione di mediatori vasoattivi. Questi canali sono tra i primi componenti di segnalazione attivati per taglio e sono stati collegati alla vasodialazione indotta da taglio attraverso la promozione della produzione di ossido nitrico (ad esempio, rettificando interiormente Ke il potenziale del recettore transitorio [TRP] canali) e iperpolarizzante dell’endotelio (ad esempio, Kir e canali Kad attivazione di calcio [KCa]) e vasoconstriction indotta da taglio attraverso un meccanismo indeterminato che coinvolge canali piezo. Comprendere il meccanismo biofisico con cui questi canali vengono attivati dalle forze di taglio (cioè direttamente o attraverso un meccano-recettore primario) potrebbe fornire potenziali nuovi obiettivi per risolvere la fisiofisiologia associata alla disfunzione endoteliale e l’aterogenesi. È ancora una grande sfida registrare l’attivazione indotta dal flusso dei canali ionici in tempo reale utilizzando l’elettrofisiologia. I metodi standard per esporre le cellule a sollecitazioni di taglio ben definite, come il reometro a cono e piastra e la camera di flusso della piastra parallela chiusa non consentono lo studio in tempo reale dell’attivazione del canale ionico. L’obiettivo di questo protocollo è quello di descrivere una camera di flusso a piastre parallele modificata che consente la registrazione elettrofisiologica in tempo reale dei canali ionici meccanosensibili sotto una sollecitazione di taglio ben definita.
Le forze emodinamiche generate dal flusso sanguigno sono ben note per svolgere ruoli importanti nella funzione endoteliale e vascolare1,2. È anche noto che diversi tipi di canali ionici rispondono acutamente ai cambiamenti nello stress di taglio3,4,5 portando all’ipotesi che i canali ionici possono essere sensori di stress da taglio primari. Più di recente, noi e altri abbiamo dimostrato che i canali ionici meccanosensitive svolgono ruoli critici in diverse funzioni vascolari sensibili allo stress di taglio, tra cui la risposta vasoattiva allo stress di taglio6,7,8 e angiogenesi dello sviluppo9. I meccanismi della sensibilità di taglio-stress dei canali ionici, tuttavia, sono quasi totalmente sconosciuti. Questa lacuna di conoscenza è probabilmente dovuta alla difficoltà tecnica di eseguire registrazioni elettrofisiologiche sotto stress di taglio ben definito. In questo articolo, quindi, forniamo un protocollo dettagliato passo dopo passo regolarmente eseguito nel nostro laboratorio per raggiungere questo obiettivo6,7,10,11.
L’obiettivo generale di questo metodo è quello di consentire l’indagine in tempo reale della meccanoattivazione del canale ionico sotto stress di taglio ben definito nella gamma fisiologica. Ciò si ottiene modificando una camera di flusso a piastre parallela standard per consentire la calatta elettrofisiologica nella camera e l’accesso alle cellule coltivate sulla piastra inferiore durante l’esposizione in tempo reale al flusso, fornendo un approccio unico per raggiungere questo obiettivo Obiettivo6,7,11. Al contrario, le camere standard a flusso di lamiere parallele, descritte nelle pubblicazioni precedenti, possono essere utilizzate per l’analisi dell’imaging in tempo reale delle cellule esposte alle forze di taglio12 o altri approcci non invasivi13,14 ma non per Elettrofisiologia. Allo stesso modo, l’apparato cono e piastra, un altro potente approccio per esporre le cellule allo stress di taglio15,16 non è adatto per registrazioni elettrofisiologiche. Pertanto, questi dispositivi di flusso non consentono l’indagine della sensibilità allo stress da taglio dei canali ionici. La difficoltà nell’eseguire registrazioni elettrofisiologiche in flusso è la ragione principale per la scarsità di informazioni sui meccanismi responsabili di questi effetti cruciali.
In termini di approcci alternativi per raggiungere lo stesso obiettivo, non ce ne sono così accurati o controllati. Alcuni studi precedenti hanno tentato di registrare l’attività del canale ionico sotto flusso esponendo le cellule a un flusso di liquido proveniente da un’altra pipetta portata in prossimità di una cella da oltre17,18. Questo è altamente non fisiologico, in quanto le forze meccaniche generate in queste condizioni hanno poco in comune con i profili fisiologici dello stress da taglio nei vasi sanguigni. Simili preoccupazioni si applicano ai tentativi di simulare lo stress fisiologico di taglio per perfusione di camere aperte. Come discusso in dettaglio nel nostro studio precedente10, un’interfaccia ad aria liquida aperta crea più disturbi e ricircolo, che sono non fisiologici. Per affrontare tutte queste preoccupazioni, abbiamo progettato una camera di flusso a piastre parallele modificata (MPP), chiamata anche “dispositivo di flusso minimamente invasivo” nei nostri studi precedenti6,7,10,11, dall’acrilico e ampiamente utilizzato nel nostro laboratorio. Tuttavia, nonostante il fatto che la descrizione originale del progetto sia stata pubblicata quasi 20 anni fa ed è l’unico dispositivo di flusso che consente di eseguire registrazioni elettrofisiologiche sotto stress di taglio ben definito, questa metodologia non è stata adottato da altri laboratori e ci sono solo pochissimi studi che tentano di registrare le correnti in flusso. Crediamo, quindi, che fornire una descrizione dettagliata per l’utilizzo della camera di flusso MPP sarà di grande aiuto per le ricerche che sono interessate acanali ionici meccanosensibili e biologia vascolare.
Il sistema vascolare è costantemente esposto a forze emodinamiche attive, che attivano canali ionici meccanosensitive3,22 ma i ruoli fisiologici di questi canali nella mechanotransduzione indotta da stress di taglio sono solo cominciando ad emergere4,6,8. I meccanismi responsabili della meccanosensibilità dei canali attivati dallo stress di taglio rimangono sconosciuti…
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato finanziato dal National Heart, Lung, and Blood Institute (R01 HL073965, IL) e (T32 HL007829-24, ISF). Gli autori vorrebbero anche riconoscere il negozio di macchine scientifiche presso l’Università dell’Illinois a Chicago per aver generato le nostre ultime camere a flusso MPP.
0.2 µm sterile syringe filters | VWR | 28145-501 | Used for filtering electrophysiolgoical pipette solution |
5 grade forceps | Fine Scientific Tools | 1252-30 | Used for transferring digested arteries to fresh solution |
9" Pasteur Pipet | Fisher Scientifc | 13-678-20D | Used for mechanically disrupting digested arteries and transferring freshly isolated endohtelial cells |
12 mm diameter Cover glass circles | Fisher Scientifc | 12-545-80 | For use with studies involving cultured cells and multiple treatments. Cells adhered to the cover glass are used for patch clamp analyses |
24 x 40 mm Rectangluar Cover glass | Sigma-Aldrich | CLS2975224 | Cover glass to be added to MPP flow chamber pieces C (Figure 1) |
24 x 50 mm Rectangluar Cover glass | Sigma-Aldrich | CLS2975245 | Cover glass to be added to MPP flow chamber E (Figure 1) |
20 gauge syringe needles | Becton Dickinson and Co | 305175 | For use in mechanical disruption of digested mesenteric arteries |
35 mm Petri dish | Genesee Scientific | 32-103 | For use in mechanical disruption of digested mesenteric arteries |
Amphotericin B solubilized | Sigma-Aldrich | A9528-50MG | Used for generating the perforated whole-cell patch configuration. |
collagenase, type I | Worthington Biochemical | 100 mg – LS004194 | Enzyme used in our laboratory as a brief digestion following the initial cocktail of neutral protease and elastase |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientifc | 67-68-5 | Solvent for Amphotericin B used in perforated whole-cell patch clamp |
elastase, lyophilized | Worthington Biochemical | 25 mg – LS002290 | Enzyme used in our laboratory in a cocktail with neutral protease/dispase to begin digestion of arteries for endothelial cell isolation. |
Falcon Tissue culture Plate, 6-well, Flat Bottom with Low Evaporation Lid | Corning | 353046 | For use with studies involving cultured cells and multiple treatments |
neutral protease/dispase | Worthington Biochemical | 10 mg- LS02100 50 mg – LS02104 | Enzyme used in our laboratory in a cocktail with elastase to begin digestion of arteries for endothelial cell isolation |
SylGard | World Precision Instruments | SYLG184 | Silicone elastomer for adhering the rectangular cover slip to the MPP flow chamber pieces C and E (Figure 1) |
Tygon ND 10-80 tubing | Microbore Tubing | AAQ04133 | ID: 0.05 in, OD: 0.09 in, inlet perfusion tubing for adminsitering flow to the chamber |