Цель юга этого протокола состоит в том, чтобы описать модифицированную камеру потока параллельных пластин для использования в исследовании активации в реальном времени механочувствительных ионных каналов сдвигами.
Стресс сдвига жидкости, как известно, играют важную роль в эндотелиальной функции. В большинстве сосудистых кроватей повышенный сдвига стресс от острого увеличения кровотока вызывает сигнальный каскад, приводящий к вазодилатации, тем самым облегчая механическую нагрузку на сосудистую стенку. Структура сдвига стресс также хорошо известно, является критическим фактором в развитии атеросклероза с ламинар сдвига стресс время атеропротектор и нарушенных сдвига стресс про-атерогенных. Хотя у нас есть детальное понимание различных промежуточных клеточных сигнальных путей, рецепторы, которые сначала переводят механический стимул в химических посредников, полностью не поняты. Механочувствительные ионные каналы имеют решающее значение для реагирования на сдвига и регулируют сигнализирующую ячейку, вызывающую таким образом производство вазоактивных посредников. Эти каналы являются одними из самых ранних активированных сигнальных компонентов для сдвига и были связаны с сдвига индуцированной вазодилатации путем поощрения производства оксида азота (например, внутренне выправляя Kи Кира и переходный потенциал рецепторов »TRP» каналы) и эндотелия гиперполяризующий фактор (например, Кир и кальций активированный K »KCa» каналов) и сдвига индуцированного сосудосуживаемого через неопределенный механизм, который включает в себя пьезо каналов. Понимание биофизического механизма, с помощью которого эти каналы активируются силами сдвига (т.е. непосредственно или через первичный механо-рецептор) может обеспечить потенциальные новые цели для решения патофизиологии, связанной с эндотелиальной дисфункцией и атерогенез. По-прежнему существует серьезная проблема для записи потокиндуированной активации ионных каналов в режиме реального времени с помощью электрофизиологии. Стандартные методы, позволяющие подвергнуть клетки четко определенному стрессу сдвига, таким как конус и реометр пластин и замкнутая камера потока параллельной пластины, не позволяют в режиме реального времени изучать активацию ионного канала. Целью этого протокола является описание модифицированной параллельной камеры потока пластины, которая позволяет в режиме реального времени электрофизиологической записи механочувствительных ионных каналов под четко определенным напряжением сдвига.
Гемодинамические силы, генерируемые кровотоком, хорошо известны, играют важную роль в эндотелиальной и сосудистой функции1,2. Также хорошо известно, что несколько типов ионных каналовостро реагируют на изменения в стрессе сдвига 3,4,5, что приводит к гипотезе, что ионные каналы могут быть первичными датчиками стресса сдвига. Совсем недавно мы и другие показали, что механочувствительные ионные каналы играют важную роль в нескольких сдвига стресса чувствительных сосудистых функций, в том числе вазоактивной реакции на сдвига стресс6,7,8 , и развития ангиогенез9. Механизмы чувствительности сдвига-стресса ионных каналов, однако, почти полностью неизвестны. Этот пробел в знаниях, вероятно, объясняется технической сложностью выполнения электрофизиологических записей при четко определенном стрессе сдвига. В этой статье, таким образом, мы предоставляем шаг за шагом подробныйпротокол обычно выполняется в нашей лаборатории для достижения этой цели 6,7,10,11.
Общая цель этого метода заключается в том, чтобы в режиме реального времени исследование ионного канала механоактивации под четко определенным напряжением сдвига в физиологическом диапазоне. Это достигается путем изменения стандартной параллельной камеры потока пластины, чтобы электрофизиологические пипетки, которые будут опущены в камеру и доступа клеток, выращенных на нижней пластине в режиме реального времени воздействия потока, обеспечивая уникальный подход для достижения этой цели цель6,7,11. В отличие от стандартных параллельных камер потока пластин, описанных в предыдущих публикациях может быть использован для анализа изображений в режиме реального времени клеток, подверженных сдвига сил12 или других неинвазивных подходов13,14, но не для Электрофизиологии. Аналогичным образом, конус и пластины аппарата, другой мощный подход подвергать клетки сдвига стресс15,16 также не подходит для электрофизиологических записей. Таким образом, эти устройства потока не позволяют исследуемую чувствительность напряжения сдвига ионных каналов. Трудность в выполнении электрофизиологических записей под потоком является основной причиной скудности информации о механизмах, ответственных за эти решающие эффекты.
С точки зрения альтернативных подходов к достижению той же цели, нет ни одного, кто был бы столь точным или контролируемым. Некоторые более предыдущие изучения попытались зафиксировать деятельность канала иона под потоком путем подвергать действию клетки к потоку жидкости приходя от другого pipette принесенных к vicinity клетки от выше17,18. Это очень нефизиологическое, так как механические силы, генерируемые в этих условиях, имеют мало общего с физиологическими профилями сдвига стресса в кровеносных сосудах. Аналогичные опасения относятся к попыткам имитировать физиологический стресс сдвига путем перфузии открытых камер. Как подробно описано в нашем предыдущем исследовании10, открытый жидко-воздушный интерфейс создает многочисленные нарушения и рециркуляции, которые являются нефизиологическими. Для решения всех этих проблем, мы разработали модифицированную параллельную пластину (MPP) системы подачи, также именуемую “минимально инвазивным устройством потока” в наших предыдущих исследованиях6,7,10,11, от акрила и широко используется в нашей лаборатории. Однако, несмотря на то, что оригинальное описание дизайна было опубликовано почти 20 лет назад и является единственным устройством потока, которое позволяет выполнять электрофизиологические записи под четко определенным напряжением сдвига, эта методология не была принятые другими лабораториями и Есть только очень мало исследований, которые пытаются зафиксировать токи под потоком. Поэтому мы считаем, что предоставление подробного описания для использования камеры потока MPP будет большим подспорьем для исследований, которые заинтересованы в механочувствительных ионных каналов и сосудистой биологии.
Сосудистая система постоянно подвергается воздействию активных гемодинамических сил, которые активируют механочувствительные ионные каналы3,22, но физиологические роли этих каналов в сдвига стресс-индуцированной механотрансдукции только начинают поя…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа финансировалась Национальным институтом сердца, легких и крови (R01 HL073965, IL) и (T32 HL007829-24, ISF). Авторы также хотели бы отметить, Научная машина магазин в Университете Иллинойса в Чикаго для генерации наших последних MPP потока камер.
0.2 µm sterile syringe filters | VWR | 28145-501 | Used for filtering electrophysiolgoical pipette solution |
5 grade forceps | Fine Scientific Tools | 1252-30 | Used for transferring digested arteries to fresh solution |
9" Pasteur Pipet | Fisher Scientifc | 13-678-20D | Used for mechanically disrupting digested arteries and transferring freshly isolated endohtelial cells |
12 mm diameter Cover glass circles | Fisher Scientifc | 12-545-80 | For use with studies involving cultured cells and multiple treatments. Cells adhered to the cover glass are used for patch clamp analyses |
24 x 40 mm Rectangluar Cover glass | Sigma-Aldrich | CLS2975224 | Cover glass to be added to MPP flow chamber pieces C (Figure 1) |
24 x 50 mm Rectangluar Cover glass | Sigma-Aldrich | CLS2975245 | Cover glass to be added to MPP flow chamber E (Figure 1) |
20 gauge syringe needles | Becton Dickinson and Co | 305175 | For use in mechanical disruption of digested mesenteric arteries |
35 mm Petri dish | Genesee Scientific | 32-103 | For use in mechanical disruption of digested mesenteric arteries |
Amphotericin B solubilized | Sigma-Aldrich | A9528-50MG | Used for generating the perforated whole-cell patch configuration. |
collagenase, type I | Worthington Biochemical | 100 mg – LS004194 | Enzyme used in our laboratory as a brief digestion following the initial cocktail of neutral protease and elastase |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientifc | 67-68-5 | Solvent for Amphotericin B used in perforated whole-cell patch clamp |
elastase, lyophilized | Worthington Biochemical | 25 mg – LS002290 | Enzyme used in our laboratory in a cocktail with neutral protease/dispase to begin digestion of arteries for endothelial cell isolation. |
Falcon Tissue culture Plate, 6-well, Flat Bottom with Low Evaporation Lid | Corning | 353046 | For use with studies involving cultured cells and multiple treatments |
neutral protease/dispase | Worthington Biochemical | 10 mg- LS02100 50 mg – LS02104 | Enzyme used in our laboratory in a cocktail with elastase to begin digestion of arteries for endothelial cell isolation |
SylGard | World Precision Instruments | SYLG184 | Silicone elastomer for adhering the rectangular cover slip to the MPP flow chamber pieces C and E (Figure 1) |
Tygon ND 10-80 tubing | Microbore Tubing | AAQ04133 | ID: 0.05 in, OD: 0.09 in, inlet perfusion tubing for adminsitering flow to the chamber |