ペリニューラル侵来は、頭頸部扁平上皮癌および他の腫瘍に対する積極的な表現型である。ひよこ絨毛膜モデルは、血管新生、癌の侵入、転移の研究に使用されています。ここでは、このモデルを生体内のペリニューラル侵入を評価するためにどのように利用できるかを示します。
周神経侵襲は、癌が神経を取り囲むか、または侵入する表現型である。頭頸部扁平上皮癌および他の癌の不十分な臨床結果に関連している。機械的研究は、神経と腫瘍細胞の間の分子クロストークが物理的相互作用の前に起こることを示しています。生体内のモデルには、特に身体的神経腫瘍相互作用が起こる前に、特に早期進行を調べるために、ペリニューラルの侵入を研究するモデルはほんのわずかです。ひよこ絨毛膜モデルは、絨毛性上皮の地下膜がヒト上皮組織の膜を模倣するので、癌の侵入を研究するために使用されてきた。ここでは、ひよこ絨毛膜モデルを再利用して、ラット背面根神経節とヒト頭頸部扁平上皮細胞を絨毛上皮上皮上皮上皮上皮に移植した。このモデルは、生体内の神経組織に侵入する癌細胞の能力を評価するうえでどのように有用であるかを実証した。
ペリニュール細胞侵食(PNI)は、頭頸部扁平上皮癌(HNC)1の患者における高疾患の再発および生存率の低下に関連する癌における研究対象の表現型である。PNIは、神経2、3内または周囲の腫瘍細胞として顕微鏡的に定義される。PNIが検出されると、患者は選択的頸部解剖および/または放射線療法4、5などのアジュバント療法を受ける可能性が高い。しかし、これらの治療法は積極的であり、PNI特異的ではありません。実際、PNIを遮断する治療法はなく、主に神経腫瘍相互作用の根底にあるメカニズムがまだ十分に理解されていないためです。
異なる分子メカニズムは、神経腫瘍の引力に関与しています。腫瘍および間質細胞は神経ペプチドおよび成長因子を放出し、ニュー泌形成を促進する6,7.インビトロで一緒に培養した場合、HNC細胞と後根神経節(DRG)の両方が強い応答を持っています。腫瘍細胞の侵入およびニューリトジェネシスに及ぼす影響は、培養6、8、9の数日後に見ることができる。しかし、侵入前に腫瘍神経相互作用を要約する生体内モデルには適切な欠如がある。ここでは、HNC細胞と神経6との初期相互作用を研究するインビボPNIモデルを提示する。我々は、ひよこ絨毛膜(CAM)モデルを神経成分を含むように適応し、CAMにDRGを移植し、続いて癌細胞の移植片を行い、内側の腫瘍微小環境を模倣した。
CAMモデルは、地下膜を介した細胞の侵入を評価するために成功し、癌腫および黒色腫の早期侵襲段階を模倣し、10、11、12。CAMは、上絨毛性上皮、介在間異泉、および下部有限性上皮で構成される。絨毛性上皮は、コラーゲンIVを豊富に含む基底膜が基礎結合組織から経口上皮を分離する基底膜をシミュレートするという点で、ヒト上皮10、13と構造的に類似している。1913年14月に最初の腫瘍移植片がCAMで行われたので、血管新生15、16、17、腫瘍進行、および腫瘍進行の評価を可能にするために、この方法の多くの適応が開発された。転移18.重要なことに、CAMに腫瘍を移植する技術はほとんど変わっていませんが、アプリケーションは継続的に進化しています。薬物スクリーニング19、骨組織工学20、およびナノ粒子系抗癌剤21を含む、複雑化のアッセイが発表されている。
私たちの研究室では、哺乳類のDRGを単離し、上部のCAMの表面に移植するCAM-DRGモデルを使用しています。DRGがCAMに組み込まれた後、HNC細胞はDRGの近くに移植され、生体内システム全体が収穫および分析される前にDRGと相互作用することを可能にする。重要なことに、このシステムは、DRGおよび腫瘍細胞の蛍光標識によってDRGおよび腫瘍の両方の生体内観察を可能にする。このプロトコルは、卵のインキュベーションからCAMの収穫まで、17日以内に行われるさまざまなレベルの複雑さの複数のステップで構成されています(図1)。目的とする異なるタンパク質を発現する細胞は、このモデルで、癌の神経侵入を引き起こす分子経路を解明し、また神経侵来を直接標的とする薬物をスクリーニングするために試験することができる。候補薬で前処理された細胞は、CAM上に移植することができ、未処理の対照と比較して調査されたPNIの発生。実際、CAMモデルは、げっ歯類19におけるインビトロ研究と前臨床試験との間の中間ステップとして薬物スクリーニングに使用されている。
実験計画は仮説によって異なります。例えば、PNI上の特定のタンパク質の役割をテストする場合、実験グループは、タンパク質を過剰発現する腫瘍細胞で移植されたDRGを含み、対照群は空のベクターで安定にトランスフェクトされた細胞を有するDRGを含むべきである。いくつかの異なる実験計画を使用して、特定の質問に対処できます。
ここで提示される生体内モデルのCAM-DRGは、腫瘍細胞による神経の物理的な侵入の前に神経腫瘍相互作用を実証することによって、以前のモデルの欠陥に対処する。PNIの生体内研究のほとんどは、腫瘍の広がりおよび運動機能の阻害に焦点を当て、坐剤神経への腫瘍細胞の直接注射に依存する23、24、25。坐剤神経注射は、癌細胞がマウスまたはラット坐神経に注入され、その後腫瘍が成長するPNIのインインインビボモデルである。注射モデルは、神経内の腫瘍細胞から生じる破壊的な腫瘍の進行および痛みを示すのに有用である。坐神経モデルは、がん細胞が神経内で繁栄することを可能にする因子の研究にも適していますが、神経鞘をバイパスして細胞を直接神経に導入するため、PNIの初期段階を評価する能力を欠いています。別のアプローチでは、外科的に移植されたオルトトピック腫瘍移植片は、前立腺癌の進行を促進する上でアドレナリンおよびコリン作動性神経線維の重要性を特徴付けるために使用され、したがって、腫瘍進行における神経の顕著な役割を示唆した。26.このモデルは、マウス交感神経および副交感神経の化学的切除から成っていた。副交感神経繊維は腫瘍組織に浸潤し、PNIに関連するプロセスであるが、このモデルは神経と腫瘍との物理的相互作用を評価するために特に使用されなかった。CAM-DRGモデルはPNIの間の神経および癌間の相互作用の調査を可能にする。さらに、マウスモデルはCAMモデルと比較して高価で時間がかかります。我々は、PNIの機械的研究のためにCAM-DRGモデルを使用することをお勧めします。
CAM-DRGアプローチのいくつかの利点は、腫瘍増殖、転移、血管新生などのPNIおよび他の表現型の評価を含む。下部CAMおよび/または肝臓におけるヒトDNAの同定は、ヒト癌細胞株10の転移の検出に使用することができ、組織断面および染色に比べてより敏感な実験的アプローチであり、これは小さな転移を明らかにしないかもしれない。
CAM-DRG法には、短い観測時間枠を含むいくつかの制限があります。胚の免疫系は、18日目27日目までに生理的に活性であり、拒絶反応および炎症過程が起こり、実験時間を制限する。また、DRGに近い腫瘍細胞を移植する際の距離を考慮することも重要です。DRG癌の距離が大きいほど、腫瘍細胞と神経との分子相互作用が損なわれたり、モデルの両方の構成要素間の物理的な接触が遅れたりする可能性があります。また、胚がこのプロトコルで規定されているよりも古い場合、胚の動きは腫瘍細胞を置き換える可能性があります。したがって、細胞移植のための10日目の受精後と一致する卵を使用することが重要である。
免疫系は18日目27日までに完全に発達していないため、CAMの腫瘍微小環境は、がん研究によく用いられる免疫抑制マウスモデルのそれと類似している。したがって、このモデルは、腫瘍進行における免疫細胞の役割を評価するのに有用ではない。もう一つの制限は、抗体、サイトカイン、プライマーなどの鶏肉種に対する試薬の入手が制限されている。
このプロトコルを正確に実行するには、練習が必要です。しかし、それは専門のコア設備を必要としないで実験室のメンバーによって行うことができる。卵殻の掘削には訓練が必要です。食料品(非受精)卵の練習は、初めてこのモデルを試みる前にお勧めします。感染を避けるためにいくつかの重要なステップに従えば、高い胚の生存とモデルの成功を達成することができます:2%ペン/ストレップでのDRGsの適切な抗生物質予防、層状流れキャビネットで働き、卵殻粒子の分散を回避カムに。また、卵のインキュベーション時間全体の間に安定した湿度を維持することも重要です。技術が習得されるまで、グループあたりの卵の数を増やすことをお勧めします。経験の浅い実験室の人員のための最も頻繁な問題は卵の汚染および細胞移植のための不正確な技術である。
DRGの収穫はまた訓練を必要とします。インビボモデルを試みる前にインビトロ実験8のためのDRGの収穫の練習をお勧めします。インビトロDRG培養は、条件を最適化し、DRG抽出の持続時間を短縮する技術を改善する機会です。DRGを鉗子でつかむ際には、収穫技術に特に注意が必要です。DRG を直接保持しないでください。圧力は、その下に適用されるべきです。抽出中に DRG をより視覚化するために、拡大レンズを使用することをお勧めします。
重要なのは、このモデルを初めて実行する場合は、すべての条件を目的のセルラインに合わせて最適化する必要があります。このモデルはラットDRGおよびHNC細胞株UM-SCC-1のために最大限に活用された。マウスDRGおよび他の癌細胞タイプの使用は、最適化を必要とする場合があります。移植細胞の濃度が高いと、腫瘍は厚く硬くなり、腫瘍の測定を容易にする傾向がある。各群に複数の卵と各卵に対する適切な細胞濃度を考慮して、実験ごとに数百万個の細胞が必要になる場合があります。計画を容易にするために、細胞の倍増時間の知識を考慮する必要があります。このプロトコルのいくつかの重要な手順については、トラブルシューティング テーブルが用意されています(表 1)。
The authors have nothing to disclose.
この作業は、NIH/NIDCR 交付金 DE027551 および DE022567 (NJD) によってサポートされました。
0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Gibco | # 25200-056 | |
ACE light source | SCHOTT North America, Inc. | Used to transilluminate the eggs | |
CellTracker Green CMFDA fluorescent dye | Life Technologies | # C7025 | Reconstitute 50µg in 20µL of DMSO and stock at -20oC. Use 1µL of stock solution/mL of culture medium. |
CellTracker Red CMTPX fluorescent dye | Life Technologies | # C34552 | Reconstitute 50µg in 40µL of DMSO and stock at -20oC. Use 1µL of stock solution/mL of culture medium |
Cordless rotary tool | DREMEL | # 866 | Used to drill the egg shell |
DMEM (1x) | Gibco | # 11965-092 | Dulbeecco`s Modified Eagle Medium |
DMSO | Fisher Bioreagents | # BP231-100 | Dimethyl Sulfoxide |
Dumont # 5 fine forceps | Fine Science Tools (FST) | # 11254-20 | Used to harvest DRG |
Egg incubator | GQF Digital Sportsman | # 1502 | Egg incubator equipped with automatic rotator, digital thermostat, temperature and humidity controls |
Engraving cutter | DREMEL | # 108 | Used to drill the egg shell |
Extra fine Graefe forceps, curved | Fine Science Tools (FST) | # 11151-10 | Used to graft DRG onto the CAM on day 8 and to harvest CAM tissue on day 17 |
Extra fine Graefe forceps, straight | Fine Science Tools (FST) | # 11150-10 | Used to graft DRG onto the CAM on day 8 and to harvest CAM tissue on day 17 |
Fertilized Lohmann White Leghorn eggs | Fertilized eggs at early fertilization days, preferably on first day post-fertilization. Eggs used in this protocol are from Michigan State University Poultry Farm. | ||
Filter Forceps | EMD Millipore | # XX6200006P | Blunt forceps used to remove the egg shell |
Fine surgical straight sharp scissor | Fine Science Tools (FST) | #14060-09 | Used to harvest the CAM tissue on day 17 |
HBSS (1x) | Gibco | # 14025-092 | Hank`s Balanced Salt Solution |
HI FBS | Gibco | # 10082-147 | Heat-inactivated Fetal Bovine Serum |
Paraffin wax membrane | Parafilm laboratory film | # PM-996 | Used to temporarily cover the egg openings until DRG grafting on day 8 |
PBS (1x) pH 7.4 | Gibco | # 10010-023 | Phosphate Buffered Saline |
Pen/Strep | Gibco | # 15140-122 | 10,000 Units/mL Penicilin, 10,000 µg/mL Streptomycin |
PFA (paraformaldehyde solution) | Sigma-Aldrich | # P6148-1KG | Dilute in water to make a 4% PFA solution |
Sprague Dawley rats (females) | Charles River laboratories | Strain code: 001 | 6-7 weeks old (190-210g in weight) |
Tegaderm Transparent Film Dressing | 3M | # 9505W | Sterile, 6x7cm, used to cover the egg openings during incubation |