الفرخ الغشاء تشوريوالانTOك في نموذج فيفو لتقييم الغزو في ما قبل البعد العصبي في سرطان الرأس والرقبة
Özet
الغزو الحولي هو نمط ظاهري عدواني لسرطان الخلايا الحرشفية للرأس والرقبة والأورام الأخرى. وقد استخدم نموذج الغشاء chorioallantoic كتكوت لدراسة تكوين الأوعية الدموية, غزو السرطان, والانبثاث. هنا نبين كيف يمكن استخدام هذا النموذج لتقييم الغزو حول العصب في الجسم الحي.
Abstract
الغزو المحيطي هو نمط ظاهري يحيط به السرطان أو يغزو الأعصاب. ويرتبط مع النتائج السريرية السيئة لسرطان الخلايا الحرشفية الرأس والرقبة وغيرها من السرطانات. وقد أظهرت الدراسات الميكانيكية أن التداخل الجزيئي بين الأعصاب والخلايا السرطانية يحدث قبل التفاعل البدني. هناك فقط عدد قليل في نماذج الحي لدراسة الغزو حول العصب، وخاصة للتحقيق في التقدم المبكر، قبل التفاعلات الفيزيائية بين الأعصاب وورم. وقد استخدم نموذج الغشاء chorioallantoic كتكوت لدراسة غزو السرطان، لأن غشاء الطابق السفلي من ظهارة المشيمية يحاكي أن من الأنسجة الظهارية البشرية. هنا نحن إعادة الغرض نموذج الغشاء chorioallantoic الفرخ للتحقيق في الغزو حول العصب، تطعيم الجرذان العضدية الجذر والرأس البشري وخلايا سرطان الخلايا الحرشفية على الظهارة المشيمية. لقد أظهرنا كيف يمكن لهذا النموذج أن يكون مفيدا لتقييم قدرة الخلايا السرطانية على غزو الأنسجة العصبية في الجسم الحي.
Introduction
الغزو قبل العصبي (PNI) هو النمط الظاهري غير مدروسة في السرطان، والذي يرتبط مع ارتفاع تكرار المرض وسوء البقاء على قيد الحياة في المرضى الذين يعانون من سرطان الخلايا الحرشفية الرأس والرقبة (HNC)1. يتم تعريف PNI مجهريا كخلايا ورم داخل أو المحيطة الأعصاب2,3. عندما يتم الكشف عن PNI، من المرجح أن يتلقى المرضى العلاجات الشبيهة بتشريح الرقبة الاختيارية و/أو العلاج الإشعاعي4و5. ومع ذلك، هذه العلاجات عدوانية، وليس PNI محددة. في الواقع، لا يوجد علاج لمنع PNI، في المقام الأول لأن الآليات الكامنة وراء التفاعلات العصبية والورم لا تزال غير مفهومة بشكل جيد.
وقد تورطت آليات جزيئية مختلفة في جذب ورم الأعصاب. الأورام والخلايا السترومالية الإفراج عن الببتيدات العصبية وعوامل النمو لتعزيز تكوين النيوتوريتيسيس6,7. عندما مثقف معا في المختبر, خلايا HNC والعُزُع الجذر الدُور (DRG) على حد سواء لها استجابة قوية; ويمكن رؤية الآثار على غزو الخلايا السرطانية ونشوء الخلايا بعد بضعة أيام في الثقافة6,8,9. ومع ذلك، هناك نقص في النماذج المناسبة في الجسم الحي لتلخيص التفاعلات بين الورم والأعصاب قبل الغزو. هنا نقدم نموذج في الجسم الحي PNI لدراسة التفاعلات المبكرة بين خلايا HNC والأعصاب6. لقد قمنا بتكييف نموذج الغشاء الشودوري الأنتيك (CAM) ليشمل مكونًا عصبيًا، وتطعيمًا لـ DRG في CAM، يليه ترقيع الخلايا السرطانية لتقليد بيئة ورم مجهرية مُتَرَكَر.
وقد استخدم نموذج CAM بنجاح لتقييم غزو الخلايا من خلال غشاء الطابق السفلي، ومحاكاة المراحل الغازية في وقت مبكر من السرطانات وسرطان الجلد10،11،12. وتتألف CAM من ظهارة المشيمية العليا، مسيينشيم التدخل، وظهارة الألانتوية السفلية. ظهارة المشيمية هي هيكليا مماثلة للظهارة البشرية10،13 في أن غشاء القبو الكولاجين الرابع الغنية يحاكي غشاء الطابق السفلي الذي يفصل ظهارة عن طريق الفم من النسيج الضام الكامنة. منذ تم تنفيذ الطعوم الورم الأول في CAM في 191314، تم تطوير العديد من التعديلات من الأسلوب للسماح لتقييم تكوين الأوعية الدموية15،16،17، تطور الورم، و الإنبثاث18. الأهم من ذلك، فإن تقنية تطعيم الأورام على CAM قد تغيرت قليلا جدا، ولكن التطبيقات تتطور باستمرار. وقد نشرت اختبارات من التعقيد المتزايد, بما في ذلك فحص المخدرات19,هندسة أنسجةالعظام20, والأدوية المضادة للسرطان الجسيمات النانوية 21 .
يستخدم مختبرنا نموذج CAM-DRG الذي يتم فيه عزل DRG الثدييات وتطعيمها على سطح CAM العلوي. بعد أن يصبح DRG مدمجة في CAM، يتم تطعيم خلايا HNC بالقرب من DRG ويسمح لها بالتفاعل مع DRG قبل حصاد وتحليل النظام الكامل في الجسم الحي. الأهم من ذلك، يسمح النظام المراقبة البصرية السابقة فيالجسم من كل من DRG والورم عن طريق وضع العلامات الفلورسنت من DRG والخلايا السرطانية. ويشمل هذا البروتوكول خطوات متعددة ذات مستويات مختلفة من التعقيد التي يتم تنفيذها في غضون17 يوما، من احتضان البيض إلى حصاد CAM (الشكل 1). الخلايا التي تعبر عن البروتينات المختلفة ذات الاهتمام يمكن اختبارها في هذا النموذج لتوضيح المسارات الجزيئية المسؤولة عن غزو الأعصاب في السرطان، وأيضا لفحص الأدوية لاستهداف الغزو العصبي مباشرة. الخلايا المعالجة مسبقا مع دواء مرشح يمكن تطعيمها على CAM وحدوث PNI التحقيق بالمقارنة مع الضوابط غير المعالجة. في الواقع، تم استخدام نموذج CAM لفحص المخدرات كخطوة وسيطة بين الدراسات في المختبر والتجارب قبل السريرية في الجسم الحي في القوارض19.
وسوف يختلف التصميم التجريبي مع الفرضية. على سبيل المثال، إذا كان اختبار دور بروتين معين على PNI، فإن المجموعة التجريبية تشمل DRG تطعيم مع الخلايا السرطانية المبالغة في البروتين، في حين أن مجموعة التحكم يجب أن تشمل DRG مع الخلايا المصابة بشكل ثابت مع ناقلات فارغة. ويمكن استخدام عدة تصاميم تجريبية مختلفة لمعالجة أسئلة محددة.
Protocol
Representative Results
Discussion
وCAM-DRG في نموذج الحي قدم هنا يعالج العجز من النماذج السابقة من خلال إظهار التفاعل العصبي والورم قبل الغزو المادي للعصب من قبل الخلايا السرطانية. معظم الدراسات في الجسم الحي من PNI التركيز على انتشار الورم وتثبيط وظيفة الحركية، وتعتمد على الحقن المباشر للخلايا السرطانية في الأعصاب الوركية23،24،25. حقن العصب الوركي هو نموذج في الجسم الحي من PNI حيث يتم حقن الخلايا السرطانية في الماوس أو العصب الوركي الفئران حيث ينمو الورم في وقت لاحق. نماذج الحقن مفيدة لإظهار تطور الورم المدمر والألم الناجم عن الخلايا السرطانية داخل الأعصاب. نموذج العصب الوركي هو أيضا مناسبة لدراسة العوامل التي تسمح للخلايا السرطانية لتزدهر في العصب ولكن يفتقر إلى القدرة على تقييم المرحلة المبكرة من PNI، لأنه يدخل الخلايا مباشرة في العصب، وتجاوز الأغلفة العصبية. في نهج مختلف، تم استخدام الطعوم الورم تقويم الرحم المزروعة جراحيا لوصف أهمية الألياف العصبية الأدرينالية والكولينية في تعزيز تطور سرطان البروستاتا، مما يشير إلى دور بارز للأعصاب في تطور الورم 26. يتكون هذا النموذج من الاستئصال الكيميائي للأعصاب القوية واللاتعاطفية. وتسللت الألياف اللاتعاطفية إلى أنسجة الورم، وهي عملية تتعلق بـ PNI، ولكن النموذج لم يستخدم على وجه التحديد لتقييم التفاعلات الجسدية بين العصب والورم. يسمح نموذج CAM-DRG بالتحقيق في التفاعلات بين العصب والسرطان أثناء PNI. وعلاوة على ذلك, نماذج مورين مكلفة وتستغرق وقتا طويلا بالمقارنة مع نموذج CAM. نقترح استخدام نموذج CAM-DRG للدراسات الميكانيكية من PNI.
بعض المزايا لنهج CAM-DRG تشمل تقييم PNI وغيرها من الأنماط الظاهرية، مثل نمو الورم، الانبثاث، وتولد الأوعية الدموية. يمكن استخدام تحديد الحمض النووي البشري على الحد الأدنى و/أو في الكبد للكشف عن الانبثاث في خطوط الخلايا السرطانية البشرية10، وهو نهج تجريبي أكثر حساسية مقارنة بتقسيم الأنسجة وتلطيخها، والتي قد لا تكشف عن الانبثاث اتس.
وطريقة CAM-DRG لها بعض القيود، بما في ذلك الإطار الزمني للمراقبة القصيرة. الجهاز المناعي للجنين نشط من الناحية الفسيولوجية بحلول اليوم 1827، عندما قد يحدث الرفض وعملية التهابية ، مما يحد من الوقت التجريبي. ومن المهم أيضا أن تنظر في المسافة عند تطعيم الخلايا السرطانية بالقرب من DRG; أكبر مسافات سرطان DRG قد يضعف التفاعلات الجزيئية بين الخلايا السرطانية والأعصاب، أو يمكن أن تؤخر الاتصال الجسدي بين كل من مكونات النموذج. أيضا، إذا كانت الأجنة أقدم من المنصوص عليها في هذا البروتوكول، قد حركات الجنين إزاحة الخلايا السرطانية. لذلك، من المهم استخدام البيض بما يتفق مع اليوم 10 بعد الإخصاب لتطعيم الخلايا.
منذ لم يتم تطوير الجهاز المناعي بشكل كامل قبل يوم 1827, والورم microenvironment في CAM يشبه ذلك من نماذج المورين المثبطة للمناعة غالبا ما تستخدم لدراسات السرطان. ولذلك، هذا النموذج ليس مفيدا لتقييم دور الخلايا المناعية في تطور الورم. وهناك قيد آخر هو محدودية توافر الكواشف لأنواع الدجاج، مثل الأجسام المضادة والسيتوكينات والتمهيديات.
ويقتضي تنفيذ هذا البروتوكول ممارسة ًا دقيقة؛ ومع ذلك، يمكن أن يتم ذلك من قبل عضو مختبر دون الحاجة إلى منشأة أساسية متخصصة. الحفر من قشرة البيض يتطلب التدريب. ينصح بممارسة على البقال (غير المخصب) البيض قبل محاولة هذا النموذج للمرة الأولى. يمكن تحقيق بقاء الجنين العالي ونجاح النموذج إذا تم اتباع بعض الخطوات الحاسمة لتجنب العدوى: الوقاية المناسبة من المضادات الحيوية DRGs في 2% القلم / العقدة، والعمل في مجلس الوزراء تدفق الصفيح، وتجنب تشتت جزيئات قذيفة البيض على كام. ومن الأهمية بمكان أيضا للحفاظ على الرطوبة مستقرة خلال الوقت حاضنة البيض مجموع. نوصي بزيادة عدد البيض لكل مجموعة حتى يتم إتقان هذه التقنية. المشاكل الأكثر شيوعا ً بالنسبة للعاملين في المختبرات عديمي الخبرة هي تلوث البيض وتقنية غير دقيقة لتطعيم الخلايا.
كما يتطلب حصاد مجموعة DRG التدريب؛ الممارسة في حصاد DRGs للتجارب في المختبر8 قبل محاولة نموذج في الجسم الحي ينصح. ثقافة DRG في المختبر هو فرصة لتحسين الظروف وتحسين تقنية لتقصير مدة استخراج DRG. مطلوب اهتمام خاص لتقنية الحصاد عند استيعاب DRG مع ملقط. ولا ينبغي أن تعقد مجموعة الـ DRG مباشرة؛ يجب أن يتم الضغط تحته. نوصي باستخدام العدسة المكبرة لتصور أفضل DRG أثناء الاستخراج.
الأهم من ذلك، عند تنفيذ هذا النموذج لأول مرة، يجب أن تكون جميع الشروط الأمثل لخط الخلية المطلوب. تم تحسين هذا النموذج للفأر DRG وخط الخلية HNC UM-SCC-1. قد يتطلب استخدام DRG الماوس وأنواع الخلايا السرطانية الأخرى التحسين. مع تركيز أعلى من الخلايا المطعمة، والأورام تميل إلى النمو أكثر سمكا وأكثر صلابة، مما يسهل قياسات الورم. مع الأخذ في الاعتبار بيض اتلال متعددة لكل مجموعة والتركيز المناسب للخلايا لكل بيضة، قد تكون هناك حاجة إلى عدة ملايين من الخلايا لكل تجربة. ولتيسير التخطيط، ينبغي أن تؤخذ في الاعتبار معرفة وقت مضاعفة الخلايا. بالنسبة لبعض الخطوات الهامة في هذا البروتوكول، يتم توفير جدول استكشاف الأخطاء وإصلاحها (الجدول1).
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا العمل من خلال منح المعهد الوطني للصحة/المعهد الوطني للتنمية الوطنية للشرطة الوطنية للتنمية في مجال مكافحة المخدرات DE027551 وDE022567 (NJD).
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Gibco | # 25200-056 | |
| ACE light source | SCHOTT North America, Inc. | Used to transilluminate the eggs | |
| CellTracker Green CMFDA fluorescent dye | Life Technologies | # C7025 | Reconstitute 50µg in 20µL of DMSO and stock at -20oC. Use 1µL of stock solution/mL of culture medium. |
| CellTracker Red CMTPX fluorescent dye | Life Technologies | # C34552 | Reconstitute 50µg in 40µL of DMSO and stock at -20oC. Use 1µL of stock solution/mL of culture medium |
| Cordless rotary tool | DREMEL | # 866 | Used to drill the egg shell |
| DMEM (1x) | Gibco | # 11965-092 | Dulbeecco`s Modified Eagle Medium |
| DMSO | Fisher Bioreagents | # BP231-100 | Dimethyl Sulfoxide |
| Dumont # 5 fine forceps | Fine Science Tools (FST) | # 11254-20 | Used to harvest DRG |
| Egg incubator | GQF Digital Sportsman | # 1502 | Egg incubator equipped with automatic rotator, digital thermostat, temperature and humidity controls |
| Engraving cutter | DREMEL | # 108 | Used to drill the egg shell |
| Extra fine Graefe forceps, curved | Fine Science Tools (FST) | # 11151-10 | Used to graft DRG onto the CAM on day 8 and to harvest CAM tissue on day 17 |
| Extra fine Graefe forceps, straight | Fine Science Tools (FST) | # 11150-10 | Used to graft DRG onto the CAM on day 8 and to harvest CAM tissue on day 17 |
| Fertilized Lohmann White Leghorn eggs | Fertilized eggs at early fertilization days, preferably on first day post-fertilization. Eggs used in this protocol are from Michigan State University Poultry Farm. | ||
| Filter Forceps | EMD Millipore | # XX6200006P | Blunt forceps used to remove the egg shell |
| Fine surgical straight sharp scissor | Fine Science Tools (FST) | #14060-09 | Used to harvest the CAM tissue on day 17 |
| HBSS (1x) | Gibco | # 14025-092 | Hank`s Balanced Salt Solution |
| HI FBS | Gibco | # 10082-147 | Heat-inactivated Fetal Bovine Serum |
| Paraffin wax membrane | Parafilm laboratory film | # PM-996 | Used to temporarily cover the egg openings until DRG grafting on day 8 |
| PBS (1x) pH 7.4 | Gibco | # 10010-023 | Phosphate Buffered Saline |
| Pen/Strep | Gibco | # 15140-122 | 10,000 Units/mL Penicilin, 10,000 µg/mL Streptomycin |
| PFA (paraformaldehyde solution) | Sigma-Aldrich | # P6148-1KG | Dilute in water to make a 4% PFA solution |
| Sprague Dawley rats (females) | Charles River laboratories | Strain code: 001 | 6-7 weeks old (190-210g in weight) |
| Tegaderm Transparent Film Dressing | 3M | # 9505W | Sterile, 6x7cm, used to cover the egg openings during incubation |
Referanslar
- Schmitd, L. B., Scanlon, C. S., D’Silva, N. J. Perineural Invasion in Head and Neck Cancer. Journal of dental research. 97 (7), 742-750 (2018).
- Liebig, C., Ayala, G., Wilks, J. A., Berger, D. H., Albo, D. Perineural invasion in cancer: a review of the literature. Cancer. 115 (15), 3379-3391 (2009).
- Schmitd, L. B., et al. Redefining Perineural Invasion: Integration of Biology With Clinical Outcome. Neoplasia (New York, N.Y). 20 (7), 657-667 (2018).
- Chinn, S. B., et al. Impact of perineural invasion in the pathologically N0 neck in oral cavity squamous cell carcinoma. Otolaryngology–head and neck surgery : official journal of American Academy of Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 149 (6), 893-899 (2013).
- Tai, S. K., Li, W. Y., Yang, M. H., Chu, P. Y., Wang, Y. F. Perineural invasion in T1 oral squamous cell carcinoma indicates the need for aggressive elective neck dissection. The American journal of surgical pathology. 37 (8), 1164-1172 (2013).
- Scanlon, C. S., et al. Galanin modulates the neural niche to favour perineural invasion in head and neck cancer. Nature communications. 6, 6885 (2015).
- Amit, M., et al. Upregulation of RET induces perineurial invasion of pancreatic adenocarcinoma. Oncogene. 36 (23), 3232-3239 (2017).
- Huyett, P., Gilbert, M., Liu, L., Ferris, R. L., Kim, S. A Model for Perineural Invasion in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma. Journal of visualized experiments : JoVE. (119), (2017).
- Ayala, G. E., et al. In vitro dorsal root ganglia and human prostate cell line interaction: redefining perineural invasion in prostate cancer. The Prostate. 49 (3), 213-223 (2001).
- Liu, M., et al. The Histone Methyltransferase EZH2 Mediates Tumor Progression on the Chick Chorioallantoic Membrane Assay, a Novel Model of Head and Neck Squamous Cell Carcinoma. Translational oncology. 6 (3), 273-281 (2013).
- Busch, C., Krochmann, J., Drews, U. The chick embryo as an experimental system for melanoma cell invasion. PloS one. 8 (1), e53970 (2013).
- Li, M., et al. The In Ovo Chick Chorioallantoic Membrane (CAM) Assay as an Efficient Xenograft Model of Hepatocellular Carcinoma. Journal of visualized experiments : JoVE. (104), (2015).
- Ota, I., Li, X. Y., Hu, Y., Weiss, S. J. Induction of a MT1-MMP and MT2-MMP-dependent basement membrane transmigration program in cancer cells by Snail1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (48), 20318-20323 (2009).
- Murphy, J. B. TRANSPLANTABILITY OF TISSUES TO THE EMBRYO OF FOREIGN SPECIES : ITS BEARING ON QUESTIONS OF TISSUE SPECIFICITY AND TUMOR IMMUNITY. The Journal of experimental medicine. 17 (4), 482-493 (1913).
- Ribatti, D., Nico, B., Vacca, A., Presta, M. The gelatin sponge-chorioallantoic membrane assay. Nature. 1 (1), 85-91 (2006).
- Auerbach, R., Arensman, R., Kubai, L., Folkman, J. Tumor-induced angiogenesis: lack of inhibition by irradiation. International journal of cancer. 15 (2), 241-245 (1975).
- Banerjee, R., et al. The G protein-coupled receptor GALR2 promotes angiogenesis in head and neck cancer. Molecular cancer therapeutics. 13 (5), 1323-1333 (2014).
- Ossowski, L., Reich, E. Experimental model for quantitative study of metastasis. Cancer research. 40 (7), 2300-2309 (1980).
- Nowak-Sliwinska, P., Segura, T., Iruela-Arispe, M. L. The chicken chorioallantoic membrane model in biology, medicine and bioengineering. Angiogenesis. 17 (4), 779-804 (2014).
- Moreno-Jimenez, I., et al. The chorioallantoic membrane (CAM) assay for the study of human bone regeneration: a refinement animal model for tissue engineering. Scientific reports. 6, 32168 (2016).
- Vu, B. T., et al. Chick chorioallantoic membrane assay as an in vivo model to study the effect of nanoparticle-based anticancer drugs in ovarian cancer. Scientific reports. 8 (1), 8524 (2018).
- Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia. BMC research notes. 9, 82 (2016).
- Cavel, O., et al. Endoneurial macrophages induce perineural invasion of pancreatic cancer cells by secretion of GDNF and activation of RET tyrosine kinase receptor. Cancer research. 72 (22), 5733-5743 (2012).
- Guo, K., et al. Interaction of the sympathetic nerve with pancreatic cancer cells promotes perineural invasion through the activation of STAT3 signaling. Molecular cancer therapeutics. 12 (3), 264-273 (2013).
- Deborde, S., et al. An In Vivo Murine Sciatic Nerve Model of Perineural Invasion. Journal of visualized experiments : JoVE. (134), (2018).
- Magnon, C., et al. . Autonomic nerve development contributes to prostate cancer progression. 341 (6142), 1236361 (2013).
- Ribatti, D. Chick embryo chorioallantoic membrane as a useful tool to study angiogenesis. International review of cell and molecular biology. 270, 181-224 (2008).
