Vivo模型中的小鸡胆膜模型,用于评估头颈部癌症的围神经入侵

伦理声明:本协议中所有使用大鼠的实验均按照我们机构的IACUC(机构动物护理和使用委员会)规则进行。在这项研究中,对卵子的实验不受IACUC监管。 1. 卵孵育(估计时间:5分钟,零天) 获得无病原体受精的商业罗曼白勒霍恩卵,最好在受精后的第一天。每个实验组在38°C和54%湿度的卵子加湿培养箱中孵育6个卵子,每小时旋转8天。使用定期旋转卵子,以防止胚胎粘在蛋膜上。注:在孵育前,将卵子保存在18°C的冰箱中,以阻止胚胎发育最多1周。 2. 收集并制备DRG(估计时间:2小时,第8天) 注:小鼠和大鼠的实验需要获得(IACUC)的批准。在一些国家,使用鸡蛋也需要批准。 获得六到七周大的斯普拉格道利大鼠(约200克的重量)来提取DRG。注:一只大鼠应产生+40个宫颈和胸腔DRG。小鼠DRG也集成在CAM中,但是这个物种的条件需要独立优化。 在层流柜中,根据在其他地方发布的小鼠DRG提取协议,从宫颈和胸腔区域收获DRG。按照图 2了解如何获取 DRG。 在注射氯胺酮/西拉辛后,通过心脏穿刺使大鼠安乐死。用70%乙醇清洁大鼠皮肤,并用剪刀去除大鼠脊柱。不要进行宫颈脱位,因为这会损害宫颈 DRG。 按照图2A-D中提供的原理图解剖表示和毛图像,用同一剪刀分离宫颈、胸腔和腰部区域。将脊柱部分放入 10 厘米培养皿中,带 1x PBS,以保持组织湿润。 用细腻的骨剪刀,打开背和腹的椎骨,将脊柱分成两个侧半部分(图2E-F)。 将组织部分放在一个干净的10厘米的菜与新鲜的1xPBS。 使用钳子,轻轻地从椎骨分离脊髓,以可视化DRG (图2G)。 在每个 DRG 下方保持细钳,抓住它,并将其从骨腔中取出。不要直接握住 DRG,因为这会导致组织损伤。不要从DRG修剪斧头束(图2H)。注:避免使用腰椎DRG,因为这些降低了CAM中的集成。对于 DRG 区域位置,请按照图 2A-D上的原理图插图和总解剖图像进行操作。 收获后立即将每个DRG放入DMEM培养基,辅以2%青霉素/链霉素(Pen/链球菌)和10%热灭活胎儿牛血清(FBS),以帮助防止DRG的细菌污染。培养皿,培养介质4mL。 收获所有DRG后,将它们转移到新的培养皿与DMEM培养基补充2%笔/链条加10S和含有1.25微克/mL的红色荧光染料。在细胞培养箱中孵育1小时。在此期间,准备鸡蛋以接收 DRG,如下所述(步骤 3)。注:收获DRG和完成荧光标记之间的间隔应足以准备卵子;DRG 可在培养箱中保存几个小时。 3. 制备用于DRG嫁接的鸡蛋(估计时间:1打鸡蛋1小时,第8天) 在层流柜中,调暗光线并照射卵子,以检查其活力和胚胎阶段。排除血管不良的卵子、未受精的卵子或与受精后第8天不一致的卵子。用自然产生的气囊轻轻地握住鸡蛋,朝向光源(图3A)。 用铅笔,标记蛋壳以接收开口 (图 3A-B)。 首先,将发育中的胚胎附着在CAM上,作为附着在蛋膜上的黑暗移动容器,并标记此区域以避免在此区域进行干预。 其次,选择操作窗口区域作为距胚胎附件至少2厘米的血管化区域,并绘制一个直径为1.5厘米的圆。距离操作窗口约 1 厘米,在血管化程度较低的区域绘制一个 0.5 厘米的正方形。 第三,绘制气囊区域,将其排除在操作区域之外。用十字架标记气囊的中间。 使用直径为 3 mm 的旋转工具和雕刻钻,在标记的正方形中钻蛋壳(图 3C)。使用钝钳去除蛋壳,而不去除外壳膜(壳底下的白膜)(图3D)。请小心工作,避免意外穿孔此膜。 使用与步骤 3.3 相同的钻头,在气囊区域标记的十字中精确穿孔,以允许空气流入鸡蛋(图 3E)。小心不要对鸡蛋施加太大的压力,以免破坏或损坏鸡蛋。 将 30 μL 的 HBSS 置于方形开口处,在完好的外壳膜上(图 3E)。使用30G注射器针,在此方形区域的外表膜中精确穿孔(图3F)。 将鸡蛋放入光源以可视化气囊。对滴珠橡胶灯泡施加压力,并将其置于气囊区域的小穿孔中(步骤 3.4)。释放灯泡中的压力,直到看到操作窗口区域中的两个膜分离(图 3G);重复此步骤的次数,以达到操作窗口区域膜的完全分离。 对所有鸡蛋重复步骤 3.1-3.6。 使用与步骤 3.3 相同的钻头,钻取圆形操作窗口时小心不要破裂外壳膜(图 3H)。通过轻轻粘上胶带来清除所有松散的颗粒,清洁鸡蛋表面。 用钝钳,从钻孔区域取出蛋壳(图3I-J)。其次,用同样的钳子,去除外蛋壳膜(图3K),小心不要在鸡蛋内引入小壳颗粒,以尽量减少污染。 在距蛋表面约 1 厘米深处识别 CAM。用石蜡蜡膜暂时覆盖每个打开的鸡蛋,以避免污染(图3L)。 对所有鸡蛋重复步骤 3.8-3.10。将卵子放回卵培养箱中,不旋转,直到 DRG 准备好进行移植。 4. 在 CAM 上移植 DRG(估计时间:40 分钟,第 8 天) 用HBSS培养基准备6厘米培养皿,在植入前清洗DRG。将准备好的鸡蛋带到细胞培养层流柜中。从鸡蛋中取出石蜡膜 (图4A)。 用精细无菌钳子,从培养基内轻轻抓住一个DRG。将其浸入 HBSS 培养基,以去除含有荧光染料的多余介质。非常轻柔地握住 DRG;否则,它会坚持在钳子上。 将 DRG 放在 CAM 上,小心不要刺穿膜 (图 4B-C)。如有必要,在将 DRG 放在 CAM 上时,使用另一对钳子帮助将 DRG 从钳尖上分离。注意:使用 HBSS 介质保持 DRG 湿润也有助于脱离钳子。 用无菌透明薄膜敷料盖住鸡蛋。盖住所有窗户和蛋壳中制成的穿刺,以避免细菌污染(图4D)。 在所有鸡蛋中嫁接DRG后,在38°C和54%湿度的加湿培养箱中孵育卵子2天,无需旋转。 5. 在 CAM 上移植肿瘤细胞(估计时间:1 小时 30 分钟,第 10 天) 在移植细胞前48小时,将培养板中所需的细胞板板。计算 UM-SCC-1 细胞每个卵子的 0.5 到 1 x 106细胞,以便在 CAM 中生成三维肿瘤。请注意,细胞数可能因细胞线而异。 吸气介质和添加 DMEM 培养基,辅以 1% 笔/链环加 10% FBS 和 2.5 μg/mL 的绿色荧光染料。在细胞培养箱中孵育1小时,在37°C下孵育。然后,检查显微镜上的荧光强度,吸气介质,用1x PBS洗涤一次,并加入0.25%胰蛋白酶长达10分钟。 在250 x g下离心4分钟,形成细胞颗粒。吸气DMEM培养基,在HBSS中重新悬浮,以洗涤多余的荧光染料。使用血细胞计对细胞进行计数。 将卵子带到细胞培养层流柜。用剪刀和钳子,打开覆盖鸡蛋的透明薄膜敷料(图4E-F)。 再次对计算出的细胞数进行离心,吸出HBSS培养基,以相同介质的5μL每5μL的6个细胞的最终浓度重新悬浮(图4G)。准备卵子总数所需的量(每个鸡蛋5 μL细胞悬浮液)。 将 5 μL 的电池溶液放入 CAM 上,距离 DRG 约 2 mm(图 4H)。在DRG和细胞之间保持均匀的距离。小心不要打扰卵子,以尽量减少细胞的扩散。注:要开始细胞植入,请选择 CAM 表面视觉干燥的卵子。如果表面太湿,细胞会扩散,不会形成常规肿瘤。 按照步骤 4.4 中的步骤,用新的薄膜敷料盖住鸡蛋。移植所有卵子中的细胞。在38°C和54%湿度下在加湿培养箱中孵育卵子7天,无需旋转。 6. 收获CAM(估计时间:1小时打鸡蛋,第17天) 用4%PFA(甲醛)pH7.0,每只鸡蛋一口,每孔2mL,制备6孔板。 把鸡蛋带到实验室的长凳上。使用连接到注射器的针头穿孔薄膜敷料,在 CAM 上滴约 300 μL 的 PFA,使 CAM 稍微变硬,从而促进收获过程。对所有鸡蛋重复此操作。 使用剪刀,取出蛋壳的上半部分(操作窗口所在的位置),并连接凸轮(图 4I)。将此半厘米的直径减小到大约 3 厘米,保持 CAM 中 DRG 和肿瘤细胞在中心进行移植的部分(图 4J)。用细钳抓住 CAM 并将其从蛋壳中分离,同时将其放入 PFA 中。朝上定向DRG和癌细胞(图4K-L)。注:3厘米区域应包括DRG和细胞。DRG 很容易被视为固定在 CAM 上的一个小肿块,但是肿瘤细胞有时在总检查时难以识别。 或者,使用剪刀,加宽操作窗口,从鸡蛋顶部取出蛋壳,同时保持 CAM 到位;移开操作窗口外约 1 厘米(图 4M),并识别 CAM 上的 DRG 和细胞(图 4N-O)。用细腻的钳子,将 CAM 放在其中一个边缘,然后轻轻抬起。用锋利细腻的剪刀,轻轻切割CAM以去除直径约3厘米的圆形区域(图4P),并将CAM置于PFA中,DRG和癌细胞朝上。注:避免在多个位置用钳子拉伸或保持 CAM,以尽量减少可能产生显微镜伪影的组织损伤。 将每个 CAM 膜放入一个井中 (图 4L)。轻轻抓住 CAM 的边缘,将组织展开在 PFA 中,或轻轻摇动板,直到 CAM 展开,以避免折叠伪影。 通过快速斩首使胚胎安乐死(第17天)。在室温下将PFA中收获的组织固定4小时。固定后,用1x PBS替换PFA,并将组织储存在4°C的PBS中,直到嵌入石蜡中进行切片。避免过度固定,以免损坏 CAM 的细腻血管。 使用荧光立体显微镜,在收获后2天内拍摄膜,以避免失去荧光信号。