Nós apresentamos um protocolo para determinar o solvente óptimo da extração para medir o cortisol da pele do Koala. Os solventes utilizados neste protocolo são metanol, etanol e isopropanol. Determinar um solvente de extração ideal ajudará na medição de peles de forma confiável para determinar o impacto do estresse crônico em coalas.
Os métodos ideais de extração hormonal utilizados para medir o stress em animais através de tipos de amostras não são sempre os mesmos. A icónica espécie marsupial da Austrália, ocoala (Phascolarctos cinereus), enfrenta a exposição prolongada a estressores antropogênicos-induzidos e a avaliação do estresse crônico em populações selvagens é urgentemente justificada. Uma das maneiras mais eficazes de medir o estresse crônico é através da análise do hormônio glicocorticóide cortisol no cabelo ou pele, uma vez que suporta respostas fisiológicas e comportamentais. Este estudo de validação laboratorial tem como objetivo testar as técnicas atuais para validar um método de extração hormonal ideal para ser usado como uma medida não invasiva de cortisol em peles de coala. Reconhece-se que o uso de técnicas não invasivas para medir os hormônios do estresse é preferível sobre técnicas tradicionais e invasivas devido a seus pontos de vista práticos e éticos ideais. Além disso, é comparativamente mais fácil de adquirir peles de coalas do que é para adquirir amostras de seu sangue. Este estudo utilizou amostras de peles de coala adquiridas do Adelaide Koala and Wildlife hospital para executar uma série de técnicas de extração hormonal na tentativa de validar um método de extração de cortisol ideal. Os resultados mostraram que o metanol de 100% forneceu a extração solvente a mais óptima comparada ao etanol de 100% ou ao isopropanol de 100% baseado em resultados do paralelismo. Em conclusão, este método da extração do cortisol da pele do Koala forneceu um ensaio não invasor de confiança que poderia ser usado para estudar o esforço crônico em koalas.
Os ecossistemas australianos sustentam a vida humana através da prestação de serviços, incluindo alimentos e fibras, entre muitas outras interações dinâmicas1. Ironicamente, é atividade humana que atua como o condutor dominante da perturbação do ecossistema através da mudança de biodiversidade2. A fragmentação do habitat, conhecida como o processo de divisão de grandes habitats contínuos em pequenas manchas de terra, isoladas umas das outras, é a maior mudança de biodiversidade antropogênica ameaçando os ecossistemas australianos2. A fragmentação do habitat modifica a estrutura e a diversidade da composição de espécies em uma determinada área, reduzindo assim a área de habitat necessária para que essas espécies mantenham populações viáveis2. O resultado disso é o aumento da concorrência entre as espécies de recursos, incluindo alimentos, combustíveis, fibras e água3. A destruição de ecossistemas australianos através da mudança de biodiversidade está tendo conseqüências catastróficas em muitas espécies nativas australianas1.
A espécie marsupial mais emblemática da Austrália, ocoala (Phascolarctos cinereus), depende dos ecossistemas australianos que permanecem saudáveis para sua sobrevivência4. A introdução do assentamento europeu causou um rápido declínio nas populações australianas de coalas, como eles foram abatidos por suas peles em busca de lucro em um grande comércio de exportação5. Esta prática foi proibida na década de 1980 e as populações de coalas foram então capazes de estabilizar5. No entanto, o crescimento exponencial da população humana resultou nesta espécie competindo por grande parte de seu habitat, e sua sobrevivência é novamente ameaça6. De acordo com a União Internacional para a conservação da natureza (IUCN), todas as populações de coalas australianas estão listadas como vulneráveis à extinção com uma tendência populacional decrescente7. Este anúncio é atribuído à incerteza em torno dos parâmetros populacionais relevantes e à variação acentuada das tendências populacionais para esta espécie7. Como os animais mais emblemáticos e endêmicos, coalas em grande parte beneficiam a economia australiana através do turismo (NSW Office of Environment and Heritage 2018). Uma estimativa sugere que o turismo relacionado Koala gerou aproximadamente 9.000 empregos e contribui entre $1.01 e $2500000000 para a economia (NSW escritório de meio ambiente e património 2018). A remoção de qualquer uma das espécies tem o potencial de ser catastrófico, e pode ser visto no declínio constante da vida selvagem australiana nativa6. Adicionalmente, a economia de Austrália sentirá as ramificações se as populações de coalas Australian continuarem a declinar na taxa que são6.
Sugere-se que a prevalência de morte e doença em resposta à fragmentação do habitat é o resultado do estresse crônico8. Já, vinte e quatro espécies marsupiais foram declaradas extintas na Austrália devido à fragmentação do habitat, com coalas seguindo uma tendência semelhante8. A complexidade da fragmentação do habitat e dos sistemas biológicos é sinergética, mas pode ser desempacotada através da análise da resposta ao estresse6. Geralmente, qualquer perturbação em um ambiente natural de animais ativa uma cascata complexa de eventos Neurohormonais, conhecida como uma resposta de “luta ou fuga”9,10. Esta resposta ao stress é um processo que começa no cérebro onde o eixo hipotálamo-hipófise-adrenal (HPA) é ativado11. Um componente do cérebro chamado hipotálamo libera o hormônio liberador de corticotrofina (CRH), que então sinaliza a hipófise anterior para liberar o hormônio adrenocorticotrófico (ACTH)11. Isso, por sua vez, estimula a secreção glicocorticóide da medula adrenal. O corpo circula glicocorticóides através do sangue, que desvia o armazenamento da glicose do glicogênio e mobiliza a glicose do glicogênio armazenado11. Esta cascata de eventos Neurohormonais é a resposta usada pelo animal para lidar com estímulos imprevisíveis11. No entanto, quando os glicocorticóides estão sendo liberados e permanecem elevados por um período prolongado de tempo, o animal é considerado como tendo estresse crônico12,13. Esse processo envolve desviar a energia de outras funções corporais corpóreas, como é necessário para a produção contínua de glicocorticóides13. Como resultado, o estresse crônico pode proibir o crescimento, a reprodução e a imunidade, sendo todos os principais traços de aptidão necessários para a sobrevida14.
Medir a produção de glicocorticóides de um animal é um indicador comum usado para determinar se o animal está ou não experimentando estresse fisiológico15. Para isso, os glicocorticóides podem ser medidos no plasma sanguíneo, soro, saliva, urina ou fezes16. No entanto, evidências sugerem que o cabelo é um indicador muito mais eficaz do estresse crônico, em oposição aos16acima mencionados. Isso é porque o cabelo é pensado para incorporar hormônios transmitidos pelo sangue durante a sua fase de crescimento; é relativamente estável; e todo o cortisol detectado no cabelo reflete o esforço fisiológico experimentado sobre o período de crescimento do cabelo, que pode ser semanas completamente aos meses16. Além disso, qualquer coleta de cortisol deve ser não invasiva, a fim de minimizar o estresse associado à captura e manuseio16. No entanto, qualquer estresse experimentado durante este evento não afetaria os níveis de glicocorticóides no cabelo16. Houve muitos estudos que exploram a proficiência de usar o cabelo para medir o stress a longo prazo em um número de animais, e incluem estudos em Rena, ursos de urso, macacos de rhesus, muskoxen, e ursos marrons17,18, 19 anos de , 20 anos de , o cortisol 21. Hair é extraído geralmente primeiramente lavando a amostra para assegurar o cortisol do suor e do sebo-derivado depositado na superfície do cabelo não é coextraído com cortisol e então pulverizando a amostra em um grânulo-batedor22. Após a lavagem, a amostra precisa de ser secada para assegurar a evaporação completa22. Finalmente, usando um solvente, a amostra pode ser extraída e reconstituída para facilitar o ensaio de cortisol22. O solvente mais comum usado para extrair o cortisol da pele é o metanol21,23; no entanto, existem alguns estudos que usam etanol e isopropanol em suas técnicas de extração de cortisol. Por exemplo, um estudo que utilizou etanol foi bem-sucedido para extrair o cortisol do fluido amniótico humano24. Adicionalmente, um estudo que utilizou isopropanol foi bem-sucedido para extrair o cortisol do cabelo humano e unhas25,26. Por esta razão, este estudo testou todos os três solventes (metanol, etanol e isopropanol) para determinar qual foi o mais bem sucedido para a extração de cortisol de amostras de peles de coala.
O objetivo preliminar deste estudo era usar técnicas atuais para validar uma técnica óptima da extração de hormona a ser usada como uma medida não invasora do cortisol da pele do Koala. Isto foi conseguido testando três solventes da extração (metanol, ethanol, e isopropanol). Nós supor que o metanol será o solvente ideal usado para extrair o cortisol da pele do Koala porque é o solvente recomendado da extração pelos jogos27do cortisol do ensaio da árvore.
Há uma série de estudos que usam uma série de técnicas para detectar o cortisol na pele de mamíferos. Este estudo apresenta resultados para a detecção de cortisol em peles coletadas de um koala selvagem exposto ao estresse antropogênico atual. Este estudo inovador usou peles para testar qual dos três solventes comumente usados são melhores na extração de cortisol, uma medida de estresse crônico, de peles de coala. Os resultados mostraram que 100% de metanol foi o solvente recomendado para extração de corti…
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi apoiado através de financiamento de pesquisa de start-up para Edward Narayan através da Western Sydney University, escola de ciência e saúde. Os autores agradecem Jack Nakhoul pela assistência com o processamento amostral.
Centrifuge Tubes | n/a | n/a | 1.5 mL |
Chrome Steel Beads | n/a | n/a | 3.2 mm x 3 |
Cortisol Kit | Arbor Assays | K003-H1W | Manufactured in Michigan USA |
DetectX Cortisol Enzyme Immunoassay Kit | Arbor Assays | K003-H5 | Used first-time for cortisol testing in koala fur |
Ethanol | n/a | n/a | HPLC Grade |
Isopropanol | n/a | n/a | HPLC Grade |
Methanol | n/a | n/a | HPLC Grade |
Micro Pipette | n/a | n/a | n/a |
Micro Precision Sieve | n/a | n/a | 0.5 mm |
Microplate Reader | Bio Radi | n/a | n/a |
Microplate Washer | Bio Radi | n/a | n/a |
Orbital Shaker | Bio Line | n/a | n/a |
Plastic Weighing Boat | n/a | n/a | n/a |
Plate Sealer | n/a | n/a | n/a |
Precision Balance | n/a | n/a | n/a |
Vortex Mixer | Eppendorf | n/a | n/a |