Özet

Cortisol meting in Koala (Phascolarctos cinereus) bont

Published: August 23, 2019
doi:

Özet

We presenteren een protocol om te bepalen van de optimale extractie oplosmiddel voor het meten van cortisol van Koala vacht. De in dit Protocol gebruikte oplosmiddelen zijn methanol, ethanol en isopropanol. Het bepalen van een optimaal extractieoplosmiddel zal helpen bij het betrouwbaar meten van de vacht om de impact van chronische stress op koala’s te bepalen.

Abstract

Optimale methoden van hormoon extractie gebruikt voor het meten van stress bij dieren over de monster soorten zijn niet altijd hetzelfde. De iconische marsupiale soort van Australië, de Koala (Phascolarctos cinereus), wordt geconfronteerd met langdurige blootstelling aan antropogene-geïnduceerde stressoren en de beoordeling van chronische stress in wilde populaties is dringend gerechtvaardigd. Een van de meest effectieve manieren om chronische stress te meten is door het analyseren van het Glucocorticoïde hormoon cortisol in haar of vacht, omdat het fysiologische en gedragsmatige reacties ondersteunt. Dit laboratorium validatie studie is bedoeld om te testen van de huidige technieken voor het valideren van een optimale hormoon extractiemethode te gebruiken als een niet-invasieve maatregel van cortisol in Koala vacht. Het is bekend dat het gebruik van niet-invasieve technieken voor het meten van stresshormonen de voorkeur heeft boven traditionele, invasieve technieken vanwege hun ideale praktische en ethische standpunten. Bovendien is het relatief gemakkelijker om bont van koala’s te verwerven dan om monsters van hun bloed te verwerven. Deze studie gebruikte monsters van Koala bont verworven van de Adelaide Koala en Wildlife Hospital om een aantal hormoon extractietechnieken uit te voeren in een poging om een optimale cortisol extractiemethode te valideren. De resultaten toonden aan dat 100% methanol de meest optimale oplosmiddelextractie leverde ten opzichte van 100% ethanol of 100% isopropanol op basis van parallellisme resultaten. Concluderend, deze methode van cortisol extractie van Koala bont verstrekt een betrouwbare niet-invasieve assay die kan worden gebruikt voor het bestuderen van chronische stress in koala’s.

Introduction

Australische ecosystemen ondersteunen het menselijk leven door het leveren van diensten, waaronder voedsel en vezels onder vele andere dynamische interacties1. Ironisch genoeg is het menselijke activiteit die opereert als de dominante drijfkracht van ecosysteem verstoring door biodiversiteits verandering2. Habitat fragmentatie, bekend als het proces van het verdelen van grote continue habitats in kleine stukjes land, geïsoleerd van elkaar, is de belangrijkste antropogene biodiversiteits verandering die de Australische ecosystemen2bedreigt. Habitat fragmentatie wijzigt de structuur en diversiteit van de soortensamenstelling in een bepaald gebied, waardoor het gebied van habitat dat voor deze soorten nodig is, wordt verminderd om levensvatbare populaties2te behouden. Het resultaat hiervan is een toegenomen concurrentie tussen soorten voor hulpbronnen, waaronder voedsel, brandstof, vezels en water3. De vernietiging van de Australische ecosystemen door het veranderen van biodiversiteit heeft catastrofale gevolgen voor veel Australische inheemse soorten1.

De meest iconische marsupiale soort van Australië, de Koala (Phascolarctos cinereus), is afhankelijk van de Australische ecosystemen die gezond blijven voor hun overleving4. De invoering van de Europese nederzetting veroorzaakte een snelle afname van de Australische populaties koala’s, omdat ze werden geslacht voor hun pelten in de winstbejag in een grote export handel5. Deze praktijk werd verboden in de jaren 1980 en populaties van koala’s waren dan in staat om te stabiliseren5. Echter, exponentiële groei van de menselijke bevolking heeft geresulteerd in deze soort concurreren voor een groot deel van hun habitat, en hun overleving is weer onder bedreiging6. Volgens de Internationale Unie voor het behoud van de natuur (IUCN) worden alle populaties van Australische koala’s als kwetsbaar voor uitsterven vermeld met een dalende bevolkings trend7. Deze vermelding wordt toegeschreven aan de onzekerheid rond relevante bevolkings parameters en een duidelijke variatie in bevolkings trends voor deze soort7. Als de meest iconische en endemische dieren, koala’s profiteren grotendeels de Australische economie door middel van toerisme (NSW kantoor van milieu en erfgoed 2018). Een schatting suggereert dat Koala gerelateerd toerisme ongeveer 9.000 banen heeft opgeleverd en bijdraagt tussen $1,1 en $2.500.000.000 aan de economie (NSW Office of Environment en Heritage 2018). Het verwijderen van één soort heeft het potentieel catastrofaal te zijn, en is te zien in de gestage achteruitgang van inheemse Australische fauna6. Bovendien, de Australië economie zal de consequenties voelen als de populaties van de Australische koala’s blijven dalen tegen het tarief dat ze zijn6.

Er wordt gesuggereerd dat de prevalentie van dood en ziekte in reactie op habitatfragmentatie het resultaat is van chronische stress8. Al vierentwintig buideldier soorten zijn verklaard uitgestorven in Australië als gevolg van habitatfragmentatie, met koala’s volgens een soortgelijke trend8. De complexiteit van habitatfragmentatie en biologische systemen is synergetisch, maar kan worden uitgepakt door analyse van de stressrespons6. Over het algemeen activeert elke verstoring in een natuurlijke omgeving van dieren een complexe cascade van neurohormonale gebeurtenissen, bekend als een ‘ gevecht of vlucht ‘ reactie9,10. Deze reactie op stress is een proces dat begint in de hersenen waar de hypothalamische-hypofyse-adrenale (HPA) as is geactiveerd11. Een onderdeel van de hersenen genaamd de hypothalamus releases corticotrophin-releasing hormoon (CRH), die vervolgens signalen van de anterieure hypofyse om adrenocorticotrofische hormoon (ACTH)11vrijgeven. Dit stimuleert op zijn beurt de Glucocorticoïde secretie van de bijnier Medulla. Het lichaam circuleert glucocorticoïden door het bloed, die de opslag van glucose uit glycogeen afleidt en glucose van opgeslagen glycogeen11mobiliseert. Deze cascade van neurohormonale gebeurtenissen is de reactie die door het dier wordt gebruikt om te gaan met onvoorspelbare stimuli11. Echter, wanneer glucocorticoïden vrijkomen en gedurende langere tijd verhoogd blijven, wordt het dier geacht chronische stress12,13te ervaren. Dit proces omvat het afleiden van energie uit de buurt van andere corporale lichaamsfuncties, omdat het nodig is voor lopende Glucocorticoïde productie13. Als gevolg daarvan, chronische stress kan het verbieden van groei, reproductie en immuniteit, alle belangrijke fitness eigenschappen die nodig zijn voor overleving14.

Het meten van de Glucocorticoïde productie van een dier is een veelgebruikte indicator die wordt gebruikt om te bepalen of het dier fysiologische stress ondervindt15. Om dit te doen, glucocorticoïden kunnen worden gemeten in bloed plasma, serum, speeksel, urine of feces16. Echter, bewijs suggereert dat haar een veel effectievere indicator van chronische stress, in tegenstelling tot de bovengenoemde16. Dit komt omdat haar wordt verondersteld te nemen bloed-overgedragen hormonen tijdens de groeifase; het is relatief stabiel; en elke cortisol gedetecteerd in haar weerspiegelt fysiologische stress ervaren over de periode van haargroei, die kan worden weken tot en met maanden16. Bovendien moet elke verzameling van cortisol niet-invasief zijn om de stress die gepaard gaat met het opvangen en hanteren van16te minimaliseren. Echter, elke stress ervaren tijdens dit evenement zou geen invloed hebben op Glucocorticoïde spiegels in haar16. Er zijn veel studies geweest die de vaardigheid van het gebruik van haren onderzoeken om lange termijn stress in een aantal dieren te meten, en omvatten studies over rendieren, grizzly beren, rhesus-apen, muskoxen en bruine beren17,18, 19 , 20 , 21. haar cortisol wordt meestal geëxtraheerd door het eerste wassen van het monster om ervoor te zorgen zweet en sebum-afgeleide cortisol afgezet op het oppervlak van het haar is niet co-geëxtraheerd met cortisol en vervolgens verpulveren het monster in een kraal-klopper22. Na het wassen moet het monster worden gedroogd om volledige verdamping te garanderen22. Tot slot, met behulp van een oplosmiddel, kan het monster worden geëxtraheerd en gereconstitueerd om de assay van cortisol22te vergemakkelijken. Het meest voorkomende oplosmiddel dat wordt gebruikt om cortisol uit de vacht te halen, is methanol21,23; echter, er zijn enkele studies die gebruik maken van ethanol en isopropanol in hun cortisol extractietechnieken. Bijvoorbeeld, een studie die ethanol gebruikte was succesvol voor het extraheren van cortisol uit humaan vrucht vocht24. Bovendien was een studie waarin isopropanol werd gebruikt succesvol voor het extraheren van cortisol uit menselijk haar en nagels25,26. Om deze reden testte deze studie alle drie de oplosmiddelen (methanol, ethanol en isopropanol) om te bepalen welke het meest succesvol was voor extractie van cortisol uit monsters van Koala vacht.

Het primaire doel van deze studie was het gebruik van de huidige technieken om te valideren van een optimale hormoon extractietechniek te worden gebruikt als een niet-invasieve maatregel van cortisol van Koala vacht. Dit werd bereikt door het testen van drie extractiemiddelen (methanol, ethanol en isopropanol). We veronderstelde dat methanol zal het optimale oplosmiddel gebruikt voor het uitpakken van cortisol van Koala vacht omdat het de aanbevolen oplosmiddel van extractie door Arbor assay cortisol kits27.

Protocol

Dit project werd uitgevoerd onder strikte richtlijnen voor dier-en menselijke zorg. De ethiek van dieren werd verleend door de Western Sydney University (A12373). Daarnaast werden een laboratorium risicobeoordeling en bioveiligheid en stralings vorm ingediend en aanvaard door de Western Sydney University om dit onderzoek veilig uit te voeren (B12366). Opmerking: Koala fur monsters voor dit project zijn verkregen uit het Adelaide Koala and Wildlife Hospital, gelegen aan de 282 Anzac Highway, Pl…

Representative Results

Assay detectie van hormoon metabolieten van belang wordt bepaald met behulp van parallellisme. Met behulp van een parallellisme curve bepaalt het binding punt 50% ook de monster verdunningsfactor op de standaard curve (Figuur 1). Zoals weergegeven in de parallellisme grafiek (Figuur 1), hebben de 100% ethanol en 100% Isopropanolextracten geen parallelle verplaatsing tegen de cortisol norm opgeleverd. Echter, de 100% methanol extract voorzag parallel verplaatsing tegen de cortisol-standaa…

Discussion

Er zijn een aantal studies die gebruik maken van een scala van technieken voor het opsporen van cortisol in zoogdier vacht. Deze studie presenteert resultaten voor de opsporing van cortisol in bont verzameld van een wilde Koala blootgesteld aan huidige antropogene stress. Deze baanbrekende studie gebruikt bont om te testen welke van de drie veelgebruikte oplosmiddelen het beste zijn bij het uitpakken van cortisol, een maat voor chronische stress, van Koala vacht. De resultaten toonden aan dat 100% methanol het aanbevolen…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd gesteund door de start-up onderzoeksfinanciering voor Edward Narayan via de Western Sydney University, school of Science and Health. De auteurs bedanken Jack Nakhoul voor hulp bij het verwerken van monsters.

Materials

Centrifuge Tubes n/a n/a 1.5 mL
Chrome Steel Beads n/a n/a 3.2 mm x 3
Cortisol Kit Arbor Assays K003-H1W Manufactured in Michigan USA
DetectX Cortisol Enzyme Immunoassay Kit Arbor Assays K003-H5 Used first-time for cortisol testing in koala fur
Ethanol n/a n/a HPLC Grade
Isopropanol n/a n/a HPLC Grade
Methanol n/a n/a HPLC Grade
Micro Pipette n/a n/a n/a
Micro Precision Sieve n/a n/a 0.5 mm
Microplate Reader Bio Radi n/a n/a
Microplate Washer Bio Radi n/a n/a
Orbital Shaker Bio Line n/a n/a
Plastic Weighing Boat n/a n/a n/a
Plate Sealer n/a n/a n/a
Precision Balance n/a n/a n/a
Vortex Mixer Eppendorf n/a n/a

Referanslar

  1. Sandhu, H. S., Crossman, N. D., Smith, F. P. Ecosystem services and Australian agricultural enterprises. Ecological Economics. 74, 19-26 (2012).
  2. Martinez-Ramos, M., Ortiz-Rodriguez, I. A., Pinero, D., Dirzo, R., Sarukhan, J. Anthropogenic disturbances jeopardize biodiversity conservation within tropical rainforest reserves. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (19), 5323-5328 (2016).
  3. Aukema, J. E., Pricope, N. G., Husak, G. J., Lopez-Carr, D. Biodiversity Areas under Threat: Overlap of Climate Change and Population Pressures on the World’s Biodiversity Priorities. PLoS ONE. 12 (1), 0170615 (2017).
  4. MacDougall, A. S., McCann, K. S., Gellner, G., Turkington, R. Diversity loss with persistent human disturbance increases vulnerability to ecosystem collapse. Nature. 494 (7435), 86-89 (2013).
  5. Hrdina, F., Gordon, G. The Koala and Possum Trade in Queensland, 1906-1936. Australian Zoologist. 32 (4), 543-585 (2004).
  6. Narayan, E. J., Williams, M. Understanding the dynamics of physiological impacts of environmental stressors on Australian marsupials, focus on the koala (Phascolarctos cinereus). BMC Zoology. 1 (1), (2016).
  7. Woinarski, J., Burbidge, A. Phascolarctos cinereus. The IUCN Red List of Threatened Species 2016. , (2016).
  8. Gonzalez-Astudillo, V., Allavena, R., McKinnon, A., Larkin, R., Henning, J. Decline causes of Koalas in South East Queensland, Australia: a 17-year retrospective study of mortality and morbidity. Scientific Reports. 7, 42587 (2017).
  9. Hing, S., Narayan, E. J., Thompson, R. C. A., Godfrey, S. S. The relationship between physiological stress and wildlife disease: consequences for health and conservation. Wildlife Research. 43 (1), 51-60 (2016).
  10. Whirledge, S., Cidlowski, J. Glucocorticoids, stree, and fertility. Minerva Endocrinologica. 35 (2), 109 (2010).
  11. Romero, L. M. Physiological stress in ecology: lessons from biomedical research. Trends in Ecology & Evolution. 19 (5), 249-255 (2004).
  12. McEwen, B. S., Wingfield, J. C. What is in a name? Integrating homeostasis, allostasis and stress. Hormones and Behavior. 57 (2), 105-111 (2010).
  13. Wingfield, J. C. The comparative biology of environmental stress: behavioural endocrinology and in ability to cope with novel, changing environments. Animal Behaviour. 85 (5), 1127-1133 (2013).
  14. Chrousos, G. P. Stress and disorders of the stress system. Nature Reviews Endocrinology. 5 (1), 374-381 (2009).
  15. Narayan, E. J., Webster, K., Nicolson, V., Mucci, A., Hero, J. M. Non-invasive evaluation of physiological stress in an iconic Australian marsupial: the Koala (Phascolarctos cinereus). General and Comparative Endocrinology. 187, 39-47 (2013).
  16. Mastromonaco, G. F., Gunn, K., McCurdy-Adams, H., Edwards, D. B., Schulte-Hostedde, A. I. Validation and use of hair cortisol as a measure of chronic stress in eastern chipmunks (Tamias striatus). Conservation Physiology. 2 (1), 055 (2014).
  17. Ashley, N. T., et al. Glucocorticosteroid concentrations in feces and hair of captive caribou and reindeer following adrenocorticotropic hormone challenge. General and Comparative Endocrinology. 172 (3), 382-391 (2011).
  18. Macbeth, B. J., Cattet, M. R. L., Stenhouse, G. B., Gibeau, M. L., Janz, D. M. Hair cortisol concentration as a noninvasive measure of long-term stress in free-ranging grizzly bears (Ursus arctos): considerations with implications for other wildlife. Canadian Journal of Zoology. 88 (10), 935-949 (2010).
  19. Dettmer, A. M., Novak, M. A., Suomi, S. J., Meyer, J. S. Physiological and behavioral adaptation to relocation stress in differentially reared rhesus monkeys: hair cortisol as a biomarker for anxiety-related responses. Psychoneuroendocrinology. 37 (2), 191-199 (2012).
  20. Di Francesco, J., et al. Qiviut cortisol in muskoxen as a potential tool for informing conservation strategies. Conservation Physiology. 5 (1), 052 (2017).
  21. Cattet, M., et al. Quantifying long-term stress in brown bears with the hair cortisol concentration: a biomarker that may be confounded by rapid changes in response to capture and handling. Conservation Physiology. 2 (1), 026 (2014).
  22. Meyer, J., Novak, M., Hamel, A., Rosenberg, K. Extraction and analysis of cortisol from human and monkey hair. Journal of Visualized Experiments. (83), e50882 (2014).
  23. Carlitz, E. H., et al. Measuring Hair Cortisol Concentrations to Assess the Effect of Anthropogenic Impacts on Wild Chimpanzees (Pan troglodytes). PLoS ONE. 11 (4), 0151870 (2016).
  24. Aderjan, R., Rauh, W., Vecsei, P., Lorenz, U., Ruttgers, H. Determination of cortisol, tetrahydrocortisol, tetrahydrocortisone, corticosterone, and aldosterone in human amniotic fluid. Journal of Steroid Biochemistry. 8 (1), 525-528 (1977).
  25. Nejad, J. G., Ghaseminezhad, M. A Cortisol Study; Facial Hair and Nails. Journal of Steroids & Hormonal Science. 7 (2), 177 (2016).
  26. Palme, R., Touma, C., Arias, N., Dominchin, M., Lepschy, M. Steroid extraction: get the best out of faecal samples. Veterinary Medicine Australia. 7 (2), 1-5 (2013).
  27. Davenport, M. D., Tiefenbacher, S., Lutz, C. K., Novak, M. A., Meyer, J. S. Analysis of endogenous cortisol concentrations in the hair of rhesus macaques. General and Comparative Endocrinology. 147 (3), 255-261 (2006).
  28. Kanse, K. S., Joshi, Y. S., Kumbharkhane, A. C. Molecular interaction study of ethanol in non-polar solute using hydrogen-bonded model. Physics and Chemistry of Liquids. 52 (6), 710-716 (2014).

Play Video

Bu Makaleden Alıntı Yapın
Charalambous, R., Narayan, E. Cortisol Measurement in Koala (Phascolarctos cinereus) Fur. J. Vis. Exp. (150), e59216, doi:10.3791/59216 (2019).

View Video