Qui, presentiamo un protocollo per progettare e fabbricare film nanostrutturati di silicio poroso (PSi) come elementi portanti degradabili per il fattore di crescita del nervo (NGF). Differenziamento neuronale e la conseguenza di PC12 cellule e topi radice dorsale neuroni gangliari (DRG) sono caratterizzati dal trattamento con i vettori di NGF-caricato PSi.
Nonostante il grande potenziale di NGF per il trattamento di malattie neurodegenerative, la sua somministrazione terapeutica rappresenta una sfida significativa come la proteina non attraversa la barriera ematomeningea, grazie alle sue proprietà chimiche e richiede quindi a lungo termine consegna al cervello per avere un effetto biologico. Questo lavoro descrive la fabbricazione di film nanostrutturati di PSi come elementi portanti degradabili di NGF per sostenuta consegna di questa proteina sensibile. I vettori di PSi sono studiate appositamente per ottenere il caricamento ad alta efficacia e rilascio continuo di NGF per un periodo di quattro settimane, pur conservando la sua attività biologica. Il comportamento degli elementi portanti della NGF-PSi come un sistema di consegna di NGF è studiato in vitro esaminando la loro capacità di indurre il differenziamento neuronale e conseguenza delle cellule PC12 e neuroni DRG dissociati. La vitalità cellulare in presenza di vettori PSi ordinate e NGF-caricato viene valutata. La bioattività di NGF rilasciato dalle portaerei PSi viene confrontata con il trattamento convenzionale delle amministrazioni di NGF gratis ripetitive. Differenziazione delle cellule PC12 è analizzata ed è caratterizzata tramite la misura di tre differenti parametri morfologici delle cellule differenziate; (i) il numero dei neurites estrazione dal soma in lunghezza (ii) il totale dei neurites e (iii) il numero dei punti di ramificazione. Le cellule PC12 trattate con i vettori di NGF-PSi dimostrano una profonda differenziazione durante tutto il periodo di rilascio. Inoltre, le cellule neuronali coltivate con i vettori di NGF-PSi DRG mostrano un’iniziazione di vasto del neurite, simili ai neuroni trattati con amministrazioni di NGF gratis ripetitive. I vettori sintonizzabili studiati dimostrano le protesi a lungo termine per il rilascio di NGF con un potenziale terapeutico per le malattie neurodegenerative.
NGF è essenziale per lo sviluppo e la manutenzione di neuroni nel sistema nervoso periferico (PNS)1 e svolge un ruolo cruciale nella sopravvivenza e nella funzione dei neuroni colinergici del forebrain basale nel sistema nervoso centrale (SNC)2. Suo alto potenziale farmacologico per il trattamento di malattie neurodegenerative centrale, quali Alzheimer e Parkinson, è stato ampiamente dimostrato, con studi clinici attualmente in corso3,4,5, 6. La più grande sfida nella consegna di NGF al SNC risiede nella sua incapacità di attraversare la barriera ematoencefalica (BBB), somministrati sistemicamente7. Inoltre, NGF suscettibilità alla degradazione enzimatica rapida rende la sua breve emivita e limita notevolmente il suo uso terapeutico8,9. Di conseguenza, c’è una sfida non soddisfatta per progettare sistemi di erogazione che consente un rilascio prolungato e controllato di NGF in modo sicuro. Vari sistemi di consegna di NGF, inclusi quelli a base di polimeri, sono stati studiati10,11,12,13,14,15, 16 , 17. i profili di rilascio di questi sistemi sono stati spesso caratterizzati da un distinto scoppio iniziale seguito da un rilascio lento e continuo, dove in quest’ultima fase il tasso di rilascio era notevolmente basso rispetto agli altri scoppio iniziale11 ,18,19. Inoltre, l’inattivazione della proteina da perdita di bioattività di NGF o prodotti di degradazione acida dei polimeri (ad es., acido poly(lactic-co-glycolic)) durante il processo di incapsulamento sono stati osservati con questo sistemi20.
Nanostrutturati PSi è caratterizzato da molte proprietà attraente, includendo la sua elevata area superficiale, grande volume poroso, biocompatibilità e degradabilità sintonizzabile in liquidi corporei, si predestining per un promettente droga consegna piattaforma21, 22,23,24,25,26,27,28. Corretta selezione delle sue condizioni di anodizzazione permette di regolare facilmente le proprietà strutturali (ad es., porosità e poro size) di PSi per sartoria carico di droga e rilascio cinetica21,27. Inoltre, vari percorsi chimici convenienti e consente di modificare la superficie del PSi e da quello ottimizzare ulteriormente il tasso di dissoluzione dell’impalcatura Si in condizioni fisiologiche e i tassi di rilascio del farmaco22,24, 29,30.
Questo lavoro si concentra sulla progettazione di un sistema di consegna basato su PSi per prolungato rilascio controllato di NGF. L’effetto degli elementi portanti della NGF-PSi sul differenziamento neuronale e la conseguenza è esaminato usando cellule PC12 e dissociato neuroni DRG. Dimostriamo che il NGF caricato ha conservato la sua bioattività inducendo la conseguenza del neurite e profonda differenziazione durante un periodo di 1 mese di rilascio all’interno di una singola somministrazione.
Film nanostrutturati degradabile PSiO2 sono fabbricati e utilizzati come elementi portanti per NGF, consentendo per il suo rilascio continuo e prolungato, pur mantenendo la sua attività biologica. Il potenziale del PSiO2 per servire come un sistema di consegna per NGF è dimostrato in vitro dimostrando la loro capacità di rilasciare dosaggio di NGF sufficiente per indurre la differenziazione neuronale e promuovere la conseguenza delle cellule PC12 e neuroni di DRG. I derivati dal film utilizzabile come serbatoi a lungo termine di NGF per futuro trattamento in vivo.
Le proprietà strutturali dei fabbricati film PSi erano studiate specificamente per i payload di NGF; la densità di corrente del processo elettrochimico acquaforte è stata regolata per ottenere la dimensione dei pori di circa 40 nm che sarebbe facilmente ospitare il NGF, una proteina con un molecular weight di 26,5 kDa32 e un diametro caratteristico di ~ 4 nm33, all’interno della matrice porosa. Inoltre, ossidazione termica dello scaffold porosi avveniva per abilitare adsorbimento fisico di NGF per attrazione elettrostatica della proteina positivamente alla superficie caricata negativamente ossidata PSi. La chimica di superficie di PSi esercita un effetto importante sull’efficacia di caricamento e può essere facilmente regolata al fine di controllare meglio le interazioni tra il payload e la matrice porosa. Successivamente, queste interazioni dettano la struttura delle molecole adsorbite proteine e loro bioattività34,35,36. In conclusione, il sistema è stato adeguato per ottenere un carico ottimale di NGF selezionando attentamente la dimensione dei pori appropriato, caratteristiche della superficie e l’ideale caricamento solvente e l’effetto risultante dei dettami parametri descritti il caricamento di proteina efficacia. Pertanto, qualsiasi cambiamento nei parametri di fabbricazione(ad esempio, densità di corrente, tempo di attacco, tipo e concentrazione del drogante o elettrolito), chimica delle superfici o la composizione della soluzione di caricamento può influenzare l’efficacia di caricamento e la bioattività della proteina caricata.
Il tasso di rilascio di un payload dall’host2PSi orPSiO generalmente è dettato da una combinazione di due meccanismi di simultanee, out-diffusione delle molecole payload e il degrado del patibolo Si37. L’erosione e la velocità di dissoluzione successiva sono interessati dal sito di impianto, sua patologia e malattia stato28,38,39. È stato stabilito nel precedente lavoro che se un tasso di rilascio diverse è necessario per una determinata applicazione terapeutica, il profilo di rilascio può essere modificato e prolungato modificando la chimica di superficie del PSi superficie38,40, 41. Varie modifiche chimiche, quali l’ossidazione termica, termica carbonizzazione e idrosililazione tecniche, sono state indicate per stabilizzare la superficie di PSi e influenzare la sua degradazione e conseguente carico utile rilascio35,42 ,43,44,45. Inoltre, caricamento del NGF in elementi portanti di legame covalente delle molecole della proteina al patibolo Si attraverso varie vie di chimica di superficie dovrebbe provocare un rilascio più prolungato perché il payload viene rilasciato solo quando i legami covalenti sono rotti o la sostegno Si matrix è degradato21.
Inoltre, seguendo il suo processo di fabbricazione, PSi può essere reso in varie configurazioni oltre a film sottile, come ad esempio microparticelle46, nanoparticelle47 o freestanding membrane26, che può essere impiegato anche come elementi portanti per NGF e soddisfare specifiche esigenze applicative.
Al fine di essere clinicamente rilevanti, il contenuto di NGF entro i PSiO2 vettori dovrebbe raggiungere l’intervallo delle dosi terapeutiche. Nel metodo descritto nel protocollo, i NGF-caricato PSiO2 vettori sono introdotti in un consistente volume di 2 mL di media delle cellule o tampone PBS e, quindi, la concentrazione della soluzione caricamento e la massa di NGF rispettiva caricata erano regolati per produrre un rilasciato la concentrazione di NGF che è rilevante per il sistema testato in vitro . Quando si utilizza questo metodo per i diversi sistemi, come ad esempio ambienti ex vivo o in vivo , la concentrazione di NGF soluzione di caricamento dovrebbe essere aumentata e regolata secondo la dose necessaria. In alternativa, più alto contenuto di NGF può essere ottenuto introducendo elementi portanti multipli per testata di superficie o utilizzando più grandi zone di PSiO2 campioni.
Inoltre, si deve osservare che in punti successivi di tempo lungo il periodo di rilascio, le concentrazioni di NGF liberate sono molto inferiori rispetto ai precedenti punti di tempo. Il fatto che il flusso di NGF non è costante nel tempo deve tener conto quando si progetta il sistema secondo le esigenze applicative.
Consegna di NGF numerosi sistemi sono stati sviluppati e riportati in letteratura, la maggior parte di loro sono sistemi a base di polimeri, composto di polimeri sintetici o naturali coniugati10,11,12,15 , 16 , 17. questi sistemi hanno dimostrato efficaci profili di rilascio prolungato, tuttavia, il periodo di rilascio ha misurato su un periodo di diversi giorni con un effetto di scoppio significativo. Alcune di queste piattaforme di distribuzione soffrono di limiti critici come perdita di bioattività sul processo di incapsulamento, che richiedono l’utilizzo di diversi stabilizzante agenti18,48, nonché sofisticate e complesse tecniche di fabbricazione16. Una delle più grandi sfide nella progettazione di sistemi di consegna per le proteine è la capacità di conservare la bioattività delle molecole all’allettamento all’interno il sistema di trasporto. Proteine o peptidi possono essere caricati in PSi/PSiO2 a RT o anche a temperature inferiori senza uso di solventi organici forti, che sono entrambi fattori importanti durante il caricamento di queste biomolecole sensibili. Gli studi precedenti hanno dimostrato che la chimica di superficie2 PSi/PSiO svolge un ruolo cruciale nel ridurre al minimo possibile denaturazione delle proteine caricato35,36. Di conseguenza, PSi/PSiO2 è un nanomateriale vantaggiosa per lo sviluppo di sistemi di consegna per i fattori di crescita in generale e di NGF in particolare.
Il lavoro attuale si concentra su come utilizzare questo metodo come nuovo approccio terapeutico per la somministrazione diretta di NGF nello SNC per il trattamento potenziale di malattie neurodegenerative. I vettori di2 PSiO NGF-caricato possono essere impiantati nel cervello di topi e l’efficacia della piattaforma come impianti a lungo termine è studiato in vivo. Inoltre, combinando questo promettente vettori con non-invasiva biolistics49,50 può abilitare uno amministrare le particelle di2 PSiO NGF-caricato in una risoluzione spaziale molto a una zona localizzata utilizzando un romanzo pneumatico pistola capillare per il trattamento di patologie neurodegenerative, dove è necessaria una somministrazione di farmaco spatiotemporal. Inoltre, NGF può dirigere la crescita neuronale in un modo gradienti chimici51, simili alle molecole di orientamento dell’assone. Così, i vettori di2 PSiO caricati possono servire come attractant hot spot di NGF, per dirigere la crescita, complementare ad altri regia spunti52,53. Inoltre, i vettori di2PSiO possono essere adattati specificamente per sostenere la consegna di NGF per un periodo di tempo molto esteso fino a diversi mesi di ulteriore ottimizzazione PSiO2 nanostruttura e sua chimica di superficie.
The authors have nothing to disclose.
MS ed ES riconosce i servizi di base e supporto dal centro di Dario I. autocarro per scienze naturali e ingegneria e il sostegno finanziario dell’Istituto di nanotecnologia Berrie Russell al Technion.
Acetone | Gadot | 830101375 | |
Amphotericin | Biological Industries | 03-028-1B | |
Aqueous HF (48%) | Merck | 101513 | |
AZ4533 photoresist | Metal Chem, Inc. | AZ4533 | |
BSA fraction v | MP biomedicals | 0216006950 | |
BSA solution (10%) | Biological Industries | 03-010-1B | |
Collagen type l | Corning Inc. | 354236 | |
Collagenase | Enco | LS004176 | |
Collagen-coated plastic coverslips | NUNC Thermanox | 1059846 | |
D-(+)-glucose | Sigma-Aldrich Chemicals | G8170 | |
Dispase-II | Sigma-Aldrich Chemicals | 4942078001 | |
Donkey anti mouse IgG H&L conjugated Alexa Fluor 488 | Abcam | ab150073 | |
Ethanol absolute (99.9%) | Merck | 818760 | |
FBS | Biological Industries | 04-121-1A | |
Formaldehyde/glutaraldehyde (2.5%) in 0.1 M sodium cacodylate | Electron Microscopy Sciences | 15949 | |
Freon | Sigma-Aldrich Chemicals | 613894 | |
Guanidine-HCl | Sigma-Aldrich Chemicals | G7294 | |
Ham's F-12 nutrient mixture | Thermo Scientific | 11765054 | |
HBSS | Thermo Scientific | 14185-045 | |
HEPES (1M) | Thermo Scientific | 15630-056 | |
HS | Biological Industries | 04-124-1A | |
Human β-NGF ELISA Development Kit | Peprotech | 900-K60 | |
Immumount solution | Thermo Scientific | 9990402 | |
L-15 medium | Sigma-Aldrich Chemicals | L5520 | |
Laminin | Thermo Scientific | 23017015 | |
L-glutamine | Biological Industries | 03-020-1A | |
Mouse anti neurofilament H (NF-H) (phosphorylated antibody) antibody | BiolLegend | SMI31P | |
Murine β-NGF | Peprotech | 450-34-20 | |
Normal donkey serum (NDS) | Sigma-Aldrich Chemicals | G9023 | |
Papain | Sigma-Aldrich Chemicals | p-4762 | |
Paraformaldehyde 16% solution | Electron Microscopy Sciences | BN15710 | |
PBS (pH 7.4) | prepared by dissolving 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, 137 mM NaCl and 2.7 mM KCl in double-distilled water (ddH2O, 18 MΩ). |
||
PBS X10 | Biological Industries | 02-020-1A | |
PC12 cell line | ATCC | CRL-1721 | |
Penicillin–streptomycin | Biological Industries | 03-032-1B | |
Percoll | Sigma-Aldrich Chemicals | p1644 | |
Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich Chemicals | P4832 | |
PrestoBlue reagent | Thermo Scientific | A13261 | |
RPMI medium | Biological Industries | 01-100-1A | |
Si wafer | Siltronix Corp. | Highly-B-doped, p-type, 0.00095 Ω-cm resistivity, <100> oriented | |
Sodium azide | Sigma-Aldrich Chemicals | S2002 | |
Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich Chemicals | S8045 | |
Tannic acid | Sigma-Aldrich Chemicals | 403040 | |
Triton X-100 | Chem-Impex International Inc. | 1279 |