Nous présentons ici un protocole visant à concevoir et fabriquer des films de silicium poreux (lb/po2) nanostructurés comme supports biodégradables pour le facteur de croissance de nerf (NGF). La différenciation neuronale et une excroissance des neurones des ganglions (DRG) racine dorsale souris et les cellules PC12 sont caractérisent par traitement avec les transporteurs chargés NGF PSi.
Malgré son grand potentiel de NGF, pour le traitement des maladies neurodégénératives, son administration thérapeutique représente un défi important tel que la protéine ne franchit pas la barrière hémato – encéphalique, en raison de ses propriétés chimiques et nécessite donc à long terme livraison vers le cerveau pour avoir un effet biologique. Cet ouvrage décrit la fabrication de films de PSi nanostructurés comme dégradables porteurs de NGF pour la prestation continue de cette protéine sensible. Les transporteurs de PSi sont taillés sur mesure pour obtenir l’efficacité de charge élevée et les rejets continus de NGF pour une période de quatre semaines, tout en préservant son activité biologique. Le comportement des transporteurs NGF-PSi comme un système de diffusion de NGF est étudiée in vitro en examinant leur capacité à induire la différenciation neuronale et une excroissance des cellules PC12 et dissocié des neurones DRG. La viabilité des cellules en présence de transporteurs de PSi NGF chargés et soignées est évaluée. La bioactivité du NGF publié auprès des transporteurs de PSi est comparée au traitement conventionnel des administrations de NGF gratuits répétitives. La différenciation des cellules PC12 est analysée et caractérisée par la mesure des trois différents paramètres morphologiques des cellules différenciées ; (i) le nombre de neurites, extraction de soma, longueur des (ii) les neurites total et (iii) le nombre de bifurcations. Les cellules PC12 traitées avec les transporteurs de NGF-PSi montrent une différenciation profonde tout au long de la période de libération. En outre, les cellules neuronales GRD cultivées avec les transporteurs de NGF-PSi montrent une initiation des neurites, semblables aux neurones traitement avec les administrations répétées de NGF gratuites. Les transporteurs accordables étudiés montrent les implants à long terme pour la libération de NGF avec un potentiel thérapeutique pour les maladies neurodégénératives.
NGF est essentiel pour le développement et la maintenance des neurones dans le système nerveux périphérique (SNP)1 et joue un rôle crucial dans la survie et la fonction des neurones cholinergiques du cerveau antérieur basal dans le système nerveux central (SNC)2. Son fort potentiel pharmacologique pour traiter les maladies neurodégénératives central, telles que l’Alzheimer et de Parkinson, a été largement démontrée, avec des essais cliniques actuellement en cours3,4,5, 6. Le plus grand défi dans la prestation de NGF au SNC réside dans son incapacité à franchir la barrière hémato-encéphalique (BHE), lorsqu’il est administré systématiquement7. En outre, la susceptibilité à la dégradation enzymatique rapide NGF restitue sa courte demi-vie et limite considérablement son utilisation thérapeutique8,9. Il y a donc un défi non satisfait à concevoir des systèmes de livraison permettant une libération prolongée et contrôlée de NGF de manière sûre. Divers systèmes de livraison de NGF, y compris les systèmes à base de polymères, ont été étudiés10,11,12,13,14,15, 16 , 17. les profils de sortie de ces systèmes sont souvent caractérisés par une explosion initiale distincte suivie d’une libération lente continue, où dans la dernière étape, le taux de libération était très faible par rapport à la première rafale11 ,18,19. En outre, l’inactivation de la protéine par les produits de dégradation de l’acide des polymères (par exemple, l’acide poly(lactic-co-glycolic)) ou de la perte de la bioactivité de NGF pendant le processus d’encapsulation ont été observés avec ce systèmes20.
Nanostructured PSi est caractérisée par plusieurs propriétés attrayantes, y compris sa grande surface, grand volume poreux, biocompatibilité et dégradabilité accordable dans les fluides corporels, il predestining pour un prometteur drogue livraison plate-forme21, 22,23,24,25,26,27,28. Une sélection adéquate de ses conditions d’anodisation permet d’ajuster facilement les propriétés structurales de PSi (p. ex., la porosité et le pore taille) pour adapter le chargement de drogue et de cinétique de libération21,27. En outre, diverses voies chimiques pratiques permettent de modifier la surface de la PSi et par là régler plus précisément le taux de dissolution de l’échafaudage Si dans des conditions physiologiques et le taux de libération de la drogue22,,24, 29,30.
Ce travail porte sur la conception d’un système de livraison lb/po2 pour Liberation prolongée du NGF. L’effet des transporteurs NGF-PSi sur la différenciation neuronale et une excroissance est examinée à l’aide de cellules PC12 et dissocié des neurones de la DRG. Nous démontrons que le NGF chargé a conservé sa bioactivité en induisant la croissance neuritique et différenciation profonde pendant une période de 1 mois communiqué au sein d’une administration unique.
Films dégradables nanostructurés AIFP2 sont fabriqués et utilisés comme supports pour NGF, permettant sa sortie continue et prolongée, tout en conservant son activité biologique. Le potentiel de l’ AIFP2 pour servir comme un système de livraison des NGF est démontré in vitro en démontrant leur capacité à libérer la dose adéquate de NGF pour induire la différenciation neuronale et de promouvoir l’excroissance des cellules PC12 et neurones DRG. Les films ingénieries peuvent servir de réservoirs à long terme du NGF pour futur traitement in vivo.
Les propriétés structurales des films PSi préfabriqués ont été adaptées spécifiquement pour la charge utile de NGF ; la densité de courant du processus de gravure électrochimique a été ajustée pour obtenir la taille des pores d’environ 40 nm qui serait facilement accueillir le NGF, une protéine avec un molecular weight de 26,5 kDa32 et un diamètre caractéristique de ~ 4 nm33, au sein de la matrice poreuse. En outre, oxydation thermique de l’échafaudage poreux a été réalisée pour permettre à l’adsorption physique de NGF par attraction électrostatique de la protéine chargée positivement à la surface de PSi oxydée chargée négativement. La chimie de surface des PSi exerce un effet majeur sur l’efficacité de chargement et peut être facilement Assemblée afin de mieux maîtriser les interactions entre la charge utile et la matrice poreuse. Ces interactions dictent par la suite la structure des molécules protéiques adsorbé et leur bioactivité34,35,36. En conclusion, le système a été ajusté pour obtenir un chargement optimal de NGF en choisissant avec soin la taille des pores approprié, caractéristiques de la surface et l’idéal chargement solvant et l’effet qui en résulte des préceptes paramètres mentionnés le chargement de la protéine efficacité. Par conséquent, tout changement dans les paramètres de fabrication (par exemple, densité de courant, temps de gravure, type et concentration de dopant ou électrolyte), chimie de surface ou composition de la solution de chargement peut affecter l’efficacité de chargement et la bioactivité de la protéines chargées.
Le taux de libération d’une charge utile de l’hôte de2PSi orPSiO est généralement dicté par une combinaison de deux mécanismes simultanés, out-diffusion des molécules de charge utile et la dégradation de l’ échafaudage de tr37. L’érosion et le taux de dissolution subséquente sont affectés par le site d’implantation, sa pathologie et la maladie état28,38,39. Il a été établi dans une étude antérieure, que si un taux différent est requis pour une certaine application thérapeutique, le profil de libération peut être modifié et prolongé en modifiant la chimie de surface du PSi surface38,40, 41. Diverses modifications chimiques, tels que l’oxydation thermique, thermique carbonisation et techniques hydrosilylation, auraient dû être divulguées pour stabiliser la surface lb/po2 et affectent sa dégradation et une charge utile version35,42 ,43,44,45. En outre, chargement du NGF dans les transporteurs par covalente de molécules de protéines à l’échafaud de Si par l’intermédiaire de diverses voies de la chimie de surface devrait se traduire par une version plus longue parce que la charge utile est libérée seulement lorsque les liaisons covalentes sont cassés ou le soutien Si matrice est dégradée21.
Par ailleurs, suite à son processus de fabrication, PSi peut être rendu dans différentes configurations en plus minces, comme les microparticules46, nanoparticules47 ou autoportantes membranes26, qui peuvent également être employées comme transporteurs NGF et besoins applicatifs spécifiques répondent.
Afin d’être cliniquement pertinent, le contenu de NGF au sein de l’AIFP2 transporteurs devrait atteindre l’éventail des doses thérapeutiques. Dans la méthode décrite dans le protocole, l’AIFP NGF-chargé2 transporteurs sont introduits dans un volume uniforme de 2 mL de milieux cellulaires ou de tampon PBS et par conséquent, la concentration de la solution de chargement et la masse de NGF respectif chargée ont été ajustés pour produire un libéré des concentration de NGF qui est pertinente pour le système testé in vitro . Lorsque vous utilisez cette méthode pour des systèmes différents, tels que les environnements ex vivo ou in vivo , la concentration de la NGF chargement de solution devrait être augmentée et ajustée en fonction de la dose nécessaire. Alternativement, une teneur plus élevée NGF trouvera en introduisant plusieurs transporteurs testés surfacique ou en utilisant de plus grands secteurs de l’AIFP2 échantillons.
En outre, il est à noter que, dans des points de temps plus tard le long de la période de libération, les concentrations de NGF libérées sont beaucoup plus faible que dans les moments plus tôt. Le fait que le flux de NGF n’est pas constant dans le temps doit prendre en considération lors de la conception du système selon les besoins de l’application.
Livraison de NGF nombreux systèmes ont été développés et rapportées dans la littérature, la plupart d’entre eux sont des systèmes à base de polymères, comprenant des polymères synthétiques ou naturels conjugués10,11,12,15 , 16 , 17. ces systèmes ont montré efficaces Liberation prolongee profils, toutefois, la période de libération répartie sur une période de plusieurs jours avec un effet de rupture significative. Certaines de ces plateformes de distribution souffrent de limites critiques tels que la perte de la bioactivité sur le processus d’encapsulation, nécessitant l’utilisation de différents stabilisateurs agents18,48, ainsi qu’il est sophistiqué et complexe techniques de fabrication16. Un des plus grands défis dans la conception de systèmes de livraison de protéines est la capacité de préserver la bioactivité des molécules sur la provocation policière au sein du système de transporteur. Peptides ou protéines peuvent être chargés dans PSi/AIFP2 RT ou même à des températures plus basses sans utilisation de solvants organiques solides, qui sont deux facteurs importants lors du chargement de ces biomolécules sensibles. Des études antérieures ont démontré que PSi/AIFP2 chimie de surface joue un rôle crucial dans la réduction éventuelle dénaturation des protéines chargées35,36. PSi/AIFP2 est donc un nanomatériau avantageux pour le développement des systèmes de livraison de facteurs de croissance en général et de NGF en particulier.
Les travaux en cours se concentre sur l’utilisation de cette méthode comme une nouvelle approche thérapeutique pour l’administration directe du NGF dans la SNC pour le traitement potentiel des maladies neurodégénératives. L’AIFP NGF-chargé2 transporteurs peuvent être implantés dans le cerveau de souris et l’efficacité de la plateforme comme implants à long terme est étudié in vivo. En outre, alliant cette prometteuse transporteurs non invasif biolistics49,,50 peuvent permettent d’administrer les particules de2 AIFP NGF-chargé dans une résolution très spatiale d’une zone localisée à l’aide d’un roman pneumatique pistolet capillaire pour le traitement des maladies neurodégénératives, où une administration de drogue spatio-temporelle est requise. En outre, NGF peut orienter la croissance neuronale dans une manière gradient chimique51, semblables aux molécules de guidage axonal. Ainsi, les transporteurs chargés de2 AIFP peuvent servir de points chauds attractant à NGF, à orienter la croissance, complémentaire aux autres dirigeant cues52,53. En outre, l’AIFP2transporteurs peuvent être taillés sur mesure pour soutenir la prestation de NGF pendant un laps de temps très étendu de jusqu’à plusieurs mois par le réglage supplémentaire de l’AIFP2 nanostructure et sa chimie de surface.
The authors have nothing to disclose.
MS et ES reconnaissent les services de base et de soutien du camion I. Lokey centre pour les sciences de la vie et de génie et de l’appui financier de l’Institut de nanotechnologie Berrie Russell au Technion.
Acetone | Gadot | 830101375 | |
Amphotericin | Biological Industries | 03-028-1B | |
Aqueous HF (48%) | Merck | 101513 | |
AZ4533 photoresist | Metal Chem, Inc. | AZ4533 | |
BSA fraction v | MP biomedicals | 0216006950 | |
BSA solution (10%) | Biological Industries | 03-010-1B | |
Collagen type l | Corning Inc. | 354236 | |
Collagenase | Enco | LS004176 | |
Collagen-coated plastic coverslips | NUNC Thermanox | 1059846 | |
D-(+)-glucose | Sigma-Aldrich Chemicals | G8170 | |
Dispase-II | Sigma-Aldrich Chemicals | 4942078001 | |
Donkey anti mouse IgG H&L conjugated Alexa Fluor 488 | Abcam | ab150073 | |
Ethanol absolute (99.9%) | Merck | 818760 | |
FBS | Biological Industries | 04-121-1A | |
Formaldehyde/glutaraldehyde (2.5%) in 0.1 M sodium cacodylate | Electron Microscopy Sciences | 15949 | |
Freon | Sigma-Aldrich Chemicals | 613894 | |
Guanidine-HCl | Sigma-Aldrich Chemicals | G7294 | |
Ham's F-12 nutrient mixture | Thermo Scientific | 11765054 | |
HBSS | Thermo Scientific | 14185-045 | |
HEPES (1M) | Thermo Scientific | 15630-056 | |
HS | Biological Industries | 04-124-1A | |
Human β-NGF ELISA Development Kit | Peprotech | 900-K60 | |
Immumount solution | Thermo Scientific | 9990402 | |
L-15 medium | Sigma-Aldrich Chemicals | L5520 | |
Laminin | Thermo Scientific | 23017015 | |
L-glutamine | Biological Industries | 03-020-1A | |
Mouse anti neurofilament H (NF-H) (phosphorylated antibody) antibody | BiolLegend | SMI31P | |
Murine β-NGF | Peprotech | 450-34-20 | |
Normal donkey serum (NDS) | Sigma-Aldrich Chemicals | G9023 | |
Papain | Sigma-Aldrich Chemicals | p-4762 | |
Paraformaldehyde 16% solution | Electron Microscopy Sciences | BN15710 | |
PBS (pH 7.4) | prepared by dissolving 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, 137 mM NaCl and 2.7 mM KCl in double-distilled water (ddH2O, 18 MΩ). |
||
PBS X10 | Biological Industries | 02-020-1A | |
PC12 cell line | ATCC | CRL-1721 | |
Penicillin–streptomycin | Biological Industries | 03-032-1B | |
Percoll | Sigma-Aldrich Chemicals | p1644 | |
Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich Chemicals | P4832 | |
PrestoBlue reagent | Thermo Scientific | A13261 | |
RPMI medium | Biological Industries | 01-100-1A | |
Si wafer | Siltronix Corp. | Highly-B-doped, p-type, 0.00095 Ω-cm resistivity, <100> oriented | |
Sodium azide | Sigma-Aldrich Chemicals | S2002 | |
Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich Chemicals | S8045 | |
Tannic acid | Sigma-Aldrich Chemicals | 403040 | |
Triton X-100 | Chem-Impex International Inc. | 1279 |