在这里, 我们提出了一个方案, 设计和制造纳米结构多孔硅 (psi) 薄膜作为可降解载体的神经生长因子 (ngf)。pc12 细胞和小鼠背根神经节 (drg) 神经元的神经分化和生长特征是在与 ngf 负载 psi 载体治疗时的特征。
尽管 ngf 在治疗神经退行性疾病方面具有巨大的潜力, 但它的治疗管理是一个重大挑战, 因为这种蛋白质由于其化学性质而没有越过血脑屏障, 因此需要长期的传递到大脑有生物作用。本研究描述了纳米结构 psi 薄膜作为 ngf 的可降解载体的制备, 以持续传递这种敏感蛋白质。psi 载体是专门为获得高负载功效和持续释放 ngf 四周, 同时保持其生物活性。通过研究 ngf-psi 载体作为 ngf 传递系统诱导 pc12 细胞和离解 drg 神经元分化和生长的能力,在体外研究了其行为。评估了在有整齐和装有 ngf 的 psi 载体的情况下的细胞活力。将 psi 载体释放的 ngf 的生物活性与重复的游离 ngf 管理的常规处理方法进行了比较。通过对三种不同形态参数的测定, 分析和表征了 pc12 细胞分化;(i) 从 soma 中提取的神经元的数目 (ii) 神经元的总长度和 (iii) 分枝点的数目。使用 ngf-psi 载体处理的 pc12 细胞在整个释放期间表现出深刻的分化。此外, 使用 ngf-psi 载体培养的 drg 神经元细胞表现出广泛的神经元起始, 类似于重复的免费 ngf 管理处理的神经元。研究的可调谐载体证明了长期植入的 ngf 释放具有治疗神经退行性疾病的潜力。
ngf 是外周神经系统 (pns)1中神经元发育和维持的关键, 对中枢神经系统 (cns) 2 基底前脑胆碱能神经元的存活和功能起着至关重要的作用.它治疗阿尔茨海默氏症和帕金森症等中枢性神经退行性疾病的高药理潜力已得到广泛证实, 临床试验目前正在进行3,4,5, 6。向中枢神经系统输送 ngf 的最大挑战在于它无法跨越血脑屏障 (bbb), 而系统地给药7。此外, ngf 对快速酶降解的敏感性使其半衰期较短, 并显著限制其治疗用途8,9。因此, 在设计能够以安全的方式长期和可控地释放 ngf 的交付系统方面存在着未得到满足的挑战。研究了各种 ngf 输送系统, 包括基于聚合物的系统,10、11、12、13、14、15 、16,17. 这些系统的释放概况的特点往往是明显的初始爆裂, 然后是缓慢的连续释放, 在后一阶段, 释放率与最初的爆裂相比明显较低11 ,18,19。此外, 在封装过程中, 观察到聚合物的酸性降解产物 (如聚 (乳酸-乙二酸) 对蛋白质的失活或在封装过程中 ngf 生物活性的丧失。
纳米结构 psi 具有多种吸引人的特性, 包括其高表面积、大孔体积、生物相容性和体液中可调谐的降解性, 注定了它是一个有前途的药物输送平台21, 22、23、24、25、26、27、28。通过正确选择阳极氧化条件, 可以轻松调整 psi 结构特性 (例如孔隙率和孔径), 以进行药物加载, 并释放动力学21、27。此外, 各种方便的化学路线允许改变 psi 的表面, 并通过进一步调整 si 支架在生理条件下的溶解率和药物 22,24的释放率, 29,30。
本工作的重点是设计一个基于 psis 的交付系统, 用于 ngf 的长控制释放。利用 pc12 细胞和离解 drg 神经元研究了 ngf-psi 载体对神经元分化和生长的影响。我们证明, 加载的 ngf 通过诱导神经元在一个单一的给药1个月的释放期内的生长和深刻分化来保持其生物活性。
可降解纳米结构 psio2 薄膜被制备并用作 ngf 的载体, 使其能够连续和长期释放, 同时保持其生物活性。psio2作为ngf 的传递系统的潜力在体外得到了证明, 证明了它们能够释放足够的 ngf 剂量, 诱导神经元分化, 促进 pc12 细胞和 drg 神经元的生长。这些工程膜可作为 ngf 的长期储集层, 用于今后的体内处理。
针对 ngf 有效载荷, 专门定制了制备的 psi 薄膜的结构性能;对电化学蚀刻过程的电流密度进行了调整, 以获得大约40纳米的孔径, 从而很容易地容纳 ngf, ngf是一种分子量为 26.5 kda 32 的蛋白质, 其特征直径约为 4 nm33,在多孔基体内。此外, 还对多孔支架进行了热氧化, 通过静电吸引带正电荷的蛋白质对带负电荷的氧化 psi 表面进行物理吸附, 使 ngf 得到物理吸附。psi 的表面化学对载荷效应有重要影响, 为了更好地控制载荷与多孔基体之间的相互作用, 可以很容易地进行调整。这些相互作用随后决定了吸附蛋白质分子的结构及其生物活性34,35,36。最后, 通过仔细选择合适的孔径、表面特性和理想的加载溶剂, 对系统进行了调整, 以获得 ngf 的最佳载荷, 由此产生的参数决定了蛋白质负载疗效。因此, 制造参数 (例如, 电流密度、蚀刻时间、掺杂物或电解质的类型和浓度)、表面化学或加载溶液成分的任何变化都会影响负载蛋白。
psi orpsio2 主机的有效载荷释放率通常由两种同时机制的组合决定, 即有效载荷分子的外扩散和 si 支架的降解37。植入部位、其病理和疾病状态28、38、39 都会影响侵蚀和随后的溶解率.在以前的工作中, 它被确定为, 如果需要不同的释放率的某种治疗应用, 释放轮廓可以修改和延长通过改变的表面化学的 psi 表面38,40, 41岁各种化学修饰, 如热氧化、热碳化和水雾化技术, 已被证明可以稳定 psi 表面, 并影响其降解和随后的有效载荷释放35,42 ,43,44,45。此外, 通过各种表面化学路线将蛋白质分子的共价附着到硅支架上, 将 ngf 加载到载体中, 应导致更长时间的释放, 因为只有当共价键破裂或支持硅矩阵降解 21。
此外, psi 在其制造过程中, 除了薄膜外, 还可以呈现成各种配置, 例如微粒子46、纳米粒子47或独立膜26, 这些薄膜也可用作载体并满足特定的应用需求。
为了与临床相关, psio2载体中的 ngf 含量应达到治疗剂量的范围。在协议中描述的方法中, 将 ngf 加载的 psio2 载波引入到2毫升的电池介质或 pbs 缓冲液中, 从而调整加载溶液的浓度和各自加载的 ngf 质量, 从而产生释放的 ngf 浓度, 这是相关的测试体外系统。当将这种方法用于不同的系统时, 如在体内或体内环境中, 应根据所需的剂量增加和调整 ngf 加载溶液的浓度。或者, 通过为每个测试区域引入多个载波或使用更大的 psio2 样品区域, 可以获得更高的 ngf 含量。
此外, 应当指出, 在释放期的后期时间点, 释放的 ngf 浓度远远低于早期的时间点。在根据应用需要设计系统时, 必须考虑到 ngf 流量不随时间变化的事实。
大量的 ngf 输送系统已经开发并在文献中得到报道, 其中大多数是聚合物基系统, 由合成聚合物共轭或天然聚合物共轭 10、11、12、15 组成.,16,17. 这些系统显示了有效的持续发布概况, 但发布期跨越了几天, 产生了重大的爆发效应。其中一些交付平台受到严重限制, 例如封装过程中的生物活性丧失, 需要使用不同的稳定剂18,48, 以及复杂和复杂的制造技术16。在设计蛋白质传递系统的最大挑战之一是能够在载体系统内被困时保持分子的生物活性。蛋白质或肽可以在 rt 或甚至在较低的温度下加载到 psi/psio2 中, 而不使用强的有机溶剂, 这两者都是加载这些敏感生物分子时的重要因素。以往的研究表明, psi/psio2表面化学在最大限度地减少负载蛋白质的可能变性方面发挥着至关重要的作用 35,36。因此, psi/psio2是开发一般生长因子输送系统, 特别是 ngf 的优势纳米材料。
目前的工作重点是利用该方法作为一种新的治疗方法, 直接给 ngf 到中枢神经系统治疗神经退行性疾病的潜在方法。ngf 负载 psio2 载体可植入小鼠大脑, 并在体内研究该平台作为长期植入物的有效性.此外, 将这种有前途的载体与非侵入性的生物学结合在一起 49,50可能使人们能够使用一种新型的气动方法, 以高度的空间分辨率将装有 ngf 的 psio2 粒子用于局部区域毛细血管枪治疗神经退行性疾病, 其中需要时空给药。此外, ngf 可以以化学梯度方式引导神经元生长51, 类似于轴突引导分子。因此, 加载的 psio2 载流子可以作为 ngf 的吸引热点, 直接生长, 与其他定向线索52,53互补.此外, psio2载体可以通过进一步调整 psio2纳米结构及其表面化学, 专门定制, 以在长达数月的时间内维持 ngf 的交付。
The authors have nothing to disclose.
ms 和 es 感谢罗瑞 i. lokey 生命科学与工程中心的核心服务和支持, 以及以色列理工学院罗素·伯里纳米技术研究所的财政支持。
Acetone | Gadot | 830101375 | |
Amphotericin | Biological Industries | 03-028-1B | |
Aqueous HF (48%) | Merck | 101513 | |
AZ4533 photoresist | Metal Chem, Inc. | AZ4533 | |
BSA fraction v | MP biomedicals | 0216006950 | |
BSA solution (10%) | Biological Industries | 03-010-1B | |
Collagen type l | Corning Inc. | 354236 | |
Collagenase | Enco | LS004176 | |
Collagen-coated plastic coverslips | NUNC Thermanox | 1059846 | |
D-(+)-glucose | Sigma-Aldrich Chemicals | G8170 | |
Dispase-II | Sigma-Aldrich Chemicals | 4942078001 | |
Donkey anti mouse IgG H&L conjugated Alexa Fluor 488 | Abcam | ab150073 | |
Ethanol absolute (99.9%) | Merck | 818760 | |
FBS | Biological Industries | 04-121-1A | |
Formaldehyde/glutaraldehyde (2.5%) in 0.1 M sodium cacodylate | Electron Microscopy Sciences | 15949 | |
Freon | Sigma-Aldrich Chemicals | 613894 | |
Guanidine-HCl | Sigma-Aldrich Chemicals | G7294 | |
Ham's F-12 nutrient mixture | Thermo Scientific | 11765054 | |
HBSS | Thermo Scientific | 14185-045 | |
HEPES (1M) | Thermo Scientific | 15630-056 | |
HS | Biological Industries | 04-124-1A | |
Human β-NGF ELISA Development Kit | Peprotech | 900-K60 | |
Immumount solution | Thermo Scientific | 9990402 | |
L-15 medium | Sigma-Aldrich Chemicals | L5520 | |
Laminin | Thermo Scientific | 23017015 | |
L-glutamine | Biological Industries | 03-020-1A | |
Mouse anti neurofilament H (NF-H) (phosphorylated antibody) antibody | BiolLegend | SMI31P | |
Murine β-NGF | Peprotech | 450-34-20 | |
Normal donkey serum (NDS) | Sigma-Aldrich Chemicals | G9023 | |
Papain | Sigma-Aldrich Chemicals | p-4762 | |
Paraformaldehyde 16% solution | Electron Microscopy Sciences | BN15710 | |
PBS (pH 7.4) | prepared by dissolving 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, 137 mM NaCl and 2.7 mM KCl in double-distilled water (ddH2O, 18 MΩ). |
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PBS X10 | Biological Industries | 02-020-1A | |
PC12 cell line | ATCC | CRL-1721 | |
Penicillin–streptomycin | Biological Industries | 03-032-1B | |
Percoll | Sigma-Aldrich Chemicals | p1644 | |
Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich Chemicals | P4832 | |
PrestoBlue reagent | Thermo Scientific | A13261 | |
RPMI medium | Biological Industries | 01-100-1A | |
Si wafer | Siltronix Corp. | Highly-B-doped, p-type, 0.00095 Ω-cm resistivity, <100> oriented | |
Sodium azide | Sigma-Aldrich Chemicals | S2002 | |
Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich Chemicals | S8045 | |
Tannic acid | Sigma-Aldrich Chemicals | 403040 | |
Triton X-100 | Chem-Impex International Inc. | 1279 |